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常用生物化学检验技术 第一节 光谱分析技术 光谱分析技术原理： * * 第五章 第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析 第三节 电泳技术 第四节 层析技术 第五节 离心技术 第六节 自动生化分析技术 　　只讲第一节，其它内容在《临床检验仪器学》中讲授。　　 本章内容概要 教学目标和要求 1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。 2、熟悉分光光度计的的基本结构和操作方法光源检查 和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的 因素 3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中 的应用。 分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。 光谱分析技术分类： 发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：比浊法 一、分光光度技术的基本原理 （一）吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即： T = I/I0 T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即： （二）Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为： A = KLC 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度 （Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。） 据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。 （三）偏离Lambert-Beer定律的因素 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。 1．光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2．化学因素： 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。 二、分光光度计的基本结构 最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计 光源 单色器 比色杯 检测器 显示器 五大部份 结构： （一）光源 光源定义： 指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。 光源种类： 可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用氢灯作为光源。 （二）单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。 种类： 滤光片 棱镜 光栅 （三）比色杯 又称为吸收池或比色皿 材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 （五）显示器 （四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。 三、分光光度计的操作方法 （一）分光光度计的基本操作 以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为： 1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上 比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A） （二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 四、分光光度技术的定性和定量方法 （一）分光光度技术的定性方法 定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε