己酮可可碱对转化生长因子-β,1诱导的大鼠腹膜间皮细胞胶原ⅠmRNA表达及细胞外信号调节激酶的作用-内科学专业论文.docxVIP

己酮可可碱对转化生长因子．13，诱导的大鼠腹膜间皮细胞胶原I 己酮可可碱对转化生长因子．13，诱导的大鼠腹膜间皮细胞胶 原I mRNA表达及细胞外信号调节激酶的作用 专 业：内科学 博士研究生：姜惠芳 导 师：余学清教授 中文摘要 持续不卧床腹膜透析(continious ambulatory peritoneal dialysis， CAPD)过程中发生的腹膜纤维化是其最严重的并发症之一，是腹膜 透析病人退出腹膜透析的重要原因之一。腹膜纤维化的主要原因是反 复发作的腹膜炎和持续的非生理性腹透液对腹膜的作用，使腹膜丧失 功能。通过对腹膜病理变化的研究发现了腹膜下胶原的沉积，甚至在 无明显的膜功能失败者也出现该现象，因此，现在的研究集中在对长 期CAPD患者腹膜功能的预防上。腹膜间皮细胞是腹膜至关重要的组 成成分，它们参与腹腔内炎症反应，并参与产生和调节细胞外基质。 在腹膜炎过程中，炎性细胞释放很多的细胞因子，这些因子又刺激了 腹膜间皮细胞的生长和胶原合成，因此可以推测腹膜间皮细胞在腹膜 纤维化的发病机理中起主要作用。 转化生长因子一B(transforming growth factor-beta．TGF．B)是重 要的生长因子，它可以增加许多细胞外基质的合成，并减少其降解。 TGF．B是组织修复的至关重要的生长因子，但其额外过分的活动会 导致组织纤维化。腹膜炎和透析液中的高糖均可使TGF．13过分合成， 一T一 现已证明人类腹膜间皮细胞可以合成TGF．13，并可被自细胞介素．1B(IL．B)上调。 现已证明人类腹膜间皮细胞可以合成TGF．13，并可被自细胞介素．1 B(IL．B)上调。 己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)已被广泛证明在肝、肾、皮肤 等组织中有明显的抗纤维化作用，可以通过抑制肝脏血小板源生长因 子(p／atelet—derived growth factor,PDGF)刺激的细胞外信号调节激酶 (extracellular signal·regulated kinase，ERK)的活性达到抗肝纤维化作 用。大量文献报道TGF．13可在多种组织如心、肝、肾、皮肤等激活 ERK通路而发挥其生物学效应，但在腹膜组织中是否存在该机制尚 无报道。 基于上述研究背景，提出以下研究内容： 1．PTX是否抑制TGF—p l诱导的腹膜问皮细胞胶原I mRNA的 表达从而达到抗纤维化作用 2．PTX是否抑制TGF．D l诱导的ERK的激活从而达到抗纤维 化作用 第一部分PⅨ对TGF．B 1诱导的大鼠腹膜间皮细胞胶原I mRNA 表达的作用 材料 雄性SD大鼠腹膜间皮细胞。 TGF—p l； 小鼠抗波形蛋白一抗； FITC标记的羊抗小鼠波形蛋白二抗； 兔抗细胞角蛋白一抗； FITC标记的羊抗兔细胞角蛋白二抗：TRIZol FITC标记的羊抗兔细胞角蛋白二抗： TRIZol RNA提取液； RT-PCR试剂盒。 方法 1、PTX对大鼠腹膜间皮细胞胶原I mRNA表达的抑制作用的 时间模式：将培养的细胞分为5组：(I)正常对照组(2)PTX 作用4小时(3)PTX作用8小时(4)PTX作用16小时(5) PTX作用24小时。于各不同时间点收取标本，用RT-PCR法检 测胶原I mRNA的表达。 结果： 正常大鼠腹膜间皮细胞表达一定量的胶原I mRNA，PTX作 用4小时可以轻度抑制胶原I mRNA表达，但统计学无显著性差 异，PTX作用8小时抑制作用明显增强(pO_01)，16小时抑制 最强(pO．001)，24小时抑制作用有减弱趋势，但与对照组相比 仍有显著性差异(plO．05)。 2、PTX对大鼠腹膜间皮细胞胶原I mRNA的抑制作用的剂量模 式：将培养的细胞分为4组：(1)正常对照组(2)PTX0．03mg／mL (3)PTX0．1 mg／mL(4)PTX0．3mg／mL， 结果：PTX0．03mg／mL组抑制作用很弱，统计学无显著性差异， PTX0．Img／mL抑制作用明显增强(p0．01)PTX0．3mg／mL抑制作用 最强(p0．01)。 3、PTX对TGF．B刺激下大鼠腹膜间皮细胞胶原I mRNA高表 达的抑制作用：将培养的细胞分为3组：(1)正常对照组(2)TGF．岱I 达的抑制作用：将培养的细胞分为3组：(1)正常对照组(2)TGF． 岱I Ing／mL(3)TGF—B 1 Ing／mL+PTX0．3mg／mL， 结果：TGF．B l对大鼠腹膜间皮细胞的胶原I mRNA的表达明显 升高(pO．05)，PTX可以明显抑制之(pO，01)。 在本研究中，我们发现随着作用时间的延长，PTX以时间依赖方 式抑制大鼠腹膜间皮细胞胶原I mRNA的基础表达，在一定的浓度范 围内呈剂量依赖性，并可