生物化学实验设计.pptVIP

生化实验设计 ——蛋白质的提取与分离纯化; 已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 ?C加热3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由，以及检测方法。;文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一定的高温，在90oC加热3-4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白分子中含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露出它的疏水基团。;整个实验过程一般可分为 5 个阶段： ①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、等）⑤分析鉴定。;一、材料的选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取的组织用4℃预 冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液 ） 。;;;b、细胞器的分离 ; 从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。 ;三、蛋白质粗提取 ;金属螯合亲和层析 ;值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。 ;五、分析鉴定;当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX， 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 ;B、定量分析;谢谢观赏！