环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因克隆与表达-动物营养与饲料科学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因，采用表达载体pET一30a(+) Vector、DGEx．4T一3 vector和宿主菌E co，f BL21对其进行了表达，并研究了 表达产物的酶学特性。主要结果如下： 本试验以具有木聚糖酶活性的环状芽孢杆菌Bc(B口cf，，“s cfrc“，册s Bc) 为出发菌株，通过对GenBank上登录的其它来源B一1，4．木聚糖酶基因序列同源 性分析，根据其保守区设计了5、端引物xP51和3、端引物XP31。采用TD—PCR 技术克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因(己被GenBank收录，其收录号为 AF490980)，该基因序列与pGEM@．T easy vector连接，获得了重组克隆子 pGEM@．T easy Bcx Vector。测序结果表明，其长度为702bp，具有一个629bp 的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码21 3个氨基酸的酶蛋白，其理 论分子量为23．2KDa。 经同源性比较发现，该环状芽孢杆菌木聚糖酶基因与GenBank上登录的 其它芽孢杆菌木聚糖酶基因如AF490979(B．5曲ff，括-2)、x07723(B．cf，c“，d疗s)、 M36648(B s“6，f，fs)、X59058(B口cf，，甜J sp．)、Z34519(B．s“6，f，fJ 168)、AF441773 (B口cfff“J sp．NBL420)和U51675(B口cf，，s sp．)具很较高同源性，其核苷酸 序列同源性分别为98％、96％、96％、97％．96％、92％和91％；氨基酸序列同 源性分别为97％、97％、97％、97％、97％、94％和94％；经分析发现该木聚糖酶 含有一个28个氨基酸的信号肽。 根据表达载体多克隆位点(Mcs)和已经克隆的木聚糖酶基因开放阅读框 设计了一对表达引物，其中上游引物XP52 5’端含有BamHI限制性酶切位点， 下游引物xP32 5’端含有XhoI限制性酶切位点。以pGEM回-T easy Bcx Vcctor 为模板，采用TD．PCR方法得到一条能编码木聚糖酶且两端带有限制性酶切位 点的DNA片段。该片段与p0EM圆．T easy Vector连接得到亚克隆重组质粒 pGEM@一T easy BCxE vector。用BamHI和xhoI双酶切亚克隆重组质粒，回收 目的片段并分别与经双酶切的表达质粒pET·30a(+)vector和pGEx_4T-3 vector 进行连接，将获得的重组表达质粒pET．BCXE和pGEX—BCXE分别导入E co，f II BL2l中，利用转化子在RBB．木聚糖平板上形成的透明圈，分别筛选到含脊重 BL2l中，利用转化子在RBB．木聚糖平板上形成的透明圈，分别筛选到含脊重 缝表达质粒p嚣T．BexE秘重组表达腰粒pGEx．BCXE的阳性表达予E。co蟊 BCE5和E foff BCEl。菌株发酵活力为135．4lU／ml和123．5U糯l，分尉为浅发 菌株的2．33储和2．13倍。 对两秘表达系统表达豹本聚糖酶嫩物学特性磷筑显示，它嬲的最适反驻湿 度均为50～60℃，在40℃以下相对稳定；最适反窿p}{均为为5，O，在pH3．O～ 9．0之间相对稳定，并与出发菌株的酶学特性基本～致。用Sephadex G，25、 Se舜adex G—lOO鞠soufce 30Q等对E∞Zi 8cE5嫠赫兹表达产物避季亍了分薅缒 傀。SDs—pAGE凝胶电泳结果显示纯化的酶蛋自分子量为20．3kDa，与成熟酶 骚白的理论值相符，表明纯化的酶蛋囱为成熟木聚糖酶，同时也表明来自环状 努箍抒蔻BC的本聚糖酶中确实存在28个氨基酸懿信号致序列。 关键词：环状芽孢杆菌：B．1，4．木聚糖酶；核苷黢序列；克隆；表达：l司源 瞧； 酶特洼 Ill The The Cloning and Expression of Xylanase E珏eoding Gene from露口c鲑如落C抛i妇露s BC Candidato： Xiao Jing Advisor： Profcssor Sun Jianyi college ofAn{mal Science，zheji8ng UniVers时 Abstr麓ct In this study the xylanase gene Of 占． c打懈“fd”5 BC was cloned and expressed in lhe最c口，j BL2 l by using pET-30a(+)and pGEX一4T*3 as expression veetofs， then the bioche￡nieal properties of expf嚣ssi