霍乱毒素B亚基和小麦小孢子特异表达β-expansin基因的表达研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

中文摘要1． 中文摘要 1． 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析 霍乱毒素B亚基(cholera toxin B submit，CTB)是霍乱毒素的无毒单位，具有很 强的免疫原性，能刺激机体产生黏膜IgA和血清IgG抗体。B亚单位的主要功能是与 有核细胞上的GMl一神经结苷脂结合而使得A亚单位进入细胞，这个功能使它在免疫佐 剂、口服疫苗与多肽衍生疫苗的研究中具有越来越重要的作用。 在本论文中，霍乱毒素B亚单位与多角体蛋白的融合基因被克隆至昆虫杆状病毒 表达载体系统(BEVS)的转移载体pBacPAK8中，使其置于多角体蛋白(polyhedfin) 基因启动子控制之下，获得重组转移载体pBacPAK-mCTB。重组转移载体DNA与经 Bsu36I酶切线眭化的修饰型病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞，然后经空 斑纯化、PCR扩增、Southem杂交等方法鉴定出含CTB基因的重组病毒 BacPAK-mCTB。将重组病毒Ba@AK—mCTB感染BmN细胞及五龄幼虫，SDS电泳分析显示重组杆状病毒的l 16kD的13．半乳糖苷酶条带缺失，证实外源基因已成功 取代了LacZ基因；Westem blotting分析发现在14kD及70kD处有分别都有明显条带。 其表达的融合蛋白产物经ELISA检测显示细胞和虫体表达分别为5．6斗g／ml及 54．4I_tg／ml，在蚕体中得到了高效表达；而GMl-ELISA说明CTB五聚体的结合GM卜 神经结苷脂的生物学功能。NOD小鼠的免疫增强实验则明显的反映了CTB的免疫试剂 及佐剂功能：它能显著增强胰岛素对自身免疫疾病的治疗效果，本实验诱导免疫耐受 的较佳组合为混合的10099胰岛素和1099 CTB含量的蚕血：而且单独喂养CTB的 NOD小鼠也显示出良好的免疫增强作用，能够延缓NOD小鼠的糖尿病发作，制止进 一步的胰岛的恶化。 2． 小麦小孢子特异表达B．expansin基因TaEXPB2的克隆与表达 Expansin是—种体外诱导分离的植物细胞壁伸展的蛋白，在修饰细胞壁基础上使 细胞膨胀。Expansin的功能众多，除了细胞生长，还包括营养生长、形态发生、授粉 受精、果实软化等，并表现出高度组织、器官和细胞特异性。 本论文在小麦小孢子特异表达阶段，经基因组DNA提取、RT-PCR、Northern及 Southern技术，首次鉴定出了一个小麦小孢子特异13一expmlsin cDNA一勋豳于础 cDNA。TaEXPB2 cDNA。TaEXPB2 cDNA转录产物在小孢子和发育的花粉早中期非常高，但在成熟花 粉、发育的种子、叶予、茎、根和子房中并未检测到。Southern杂交分析显示TaEXPB2 cDNA可能是一个大expmasin家族的小亚家族的一员，显示TaEXPB2明显不同于在成 熟花粉中高度表达的I类过敏原。这是首次报告在雄幽B体发育早中期特异性表达而 在成熟花粉中不表达的类I类同源过敏原(D．extmnsins)。 将TaEXPB2基因克隆进入原核表达载体pGEx4T-1，纯化的GST融合蛋白显示基 因己成功克隆入载体，并获得诱导表达成功。根据TaEXPB2基因序列设计合成小段多 肽免疫兔子，获得兔源抗TaEXPB2多肽的多克隆抗体，经ELISA检测其效价至少为 5×104。以其作为一抗用以Western检测诱导表达的TaEXPB2融合蛋白，显示了清晰的 目的融合蛋白条带。将TaEXPB2基因克隆进入家蚕杆状病毒表达载体系统中进行高效 表达，目前对该重组病毒的筛选及鉴定工作正在进行中，经过PCR鉴定表明基因已经 整合进入病毒载体，表达纯化后可进一步的表达研究TaEXPB2的生物学功能。 关键词：霍乱毒素B亚单位霍乱毒素B亚单位和多角体的融合蛋白 Expansin TaEXPB2基因GST家蚕核型多角体病毒杆状病毒表达载体系统免疫 耐受 Abstract1．ExpressionofcholeratoxinB Abstract 1．ExpressionofcholeratoxinB subunitinBombyxmoribaculovirus expressionvector system and its activity assys in vitro Thenon-toxiccholeratoxinB subunit(CTB)，withvery strongimmunogenicity,mighthelp to stinMate mucosal IgA and serum IgG The principal崩狮of B subanit is GMl一ganglioside，a glycosphingolipid found ubiquitou