火菇素结构及抗肿瘤活性的初步研究-微生物学专业论文.docx

火菇素结构及抗肿瘤活性的初步研究摘要 火菇素结构及抗肿瘤活性的初步研究 摘要 (手术、放射疗法、化学药物治疗以及免疫疗法是目前肿瘤治疗几种方法， 另外，基因疗法正处于探索性阶段。随着肿瘤特异性抗原的证实及机体的免 疫功能阻止肿瘤的发生和发展现象的发现，免疫疗法越来越受世人重视，并 、 且有越来越多的免疫治疗剂用于临床≯近年来试验表明，食用菌中的某些多 糖、糖蛋白、蛋白质及其它多种小分子物质等对肿瘤有较强的抑制作用。其 中．金针菇中的抗肿瘤物质尤为丰富，其予实体、菌丝体和发酵液中均含有 抗肿瘤蛋白、多糖和糖蛋白。 ， (经过条件摸索，初步完善了火菇素的提取工艺。金针菇风干子实体剪碎， L 酸化水4。C浸提24小时，纱布挤滤所得滤液经70％饱和度的硫铵沉淀，然后 再经50％一75％浓度的乙醇分级沉淀，透析去乙醇后，上DEAE．Sephadex和 CM·Sephadex离子交换柱即得火菇素纯品。 测定了火菇素的若干理化性质。苯酚．硫酸法测定表明火菇素不含糖：微 量凯氏定氮法测定表明此蛋白含氮量为16．2％：聚丙烯酰胺等电聚焦电泳显 示火菇素的等电点为pH8．9，是一碱性蛋白：火菇素的N．末端经DNS分析 法证明为缬氨酸；酸水解法测定了此蛋白的氨基酸组成，证明此蛋白不含甲 硫氨酸，富含天门冬氨酸和丙氨酸，酸性氨基酸的数量多于碱性氨基酸的总 数，但此蛋白等电点为pH8．9，说明酸性氨基酸大多处于分子内部或多以酰 胺形式存在。另外，SDS．PAGE测定此蛋白分子量为21．3kDa，用Sephadex G．75分子筛测定它的表观分子量为24．8kDa，两者比较可知，此蛋白为单亚 基蛋白。用ESI．MS和MALDl．TOF．MS首次精确测定了火菇素的分子量为 I 19873，误差为0．1％．0．01％。目前火菇素还没有简便易行的检测方法，不利于在提取过程中对其跟踪。 19873，误差为0．1％．0．01％。 目前火菇素还没有简便易行的检测方法，不利于在提取过程中对其跟踪。 火菇素用Freund完全佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内，经数次加强免疫后 采血并分离了抗血清，免疫双扩散显示它能与火菇素形成免疫沉淀线，当抗 原浓度为lm∥mL时，抗血清效价在1：16以上。根据火茹素在血清平板上 免疫单向琼脂扩散的结果，建立了不同浓度火菇素免疫反应的标准曲线，可 用于火菇素的定量检测。然后据此对在4。C下保存的火菇素进行了长期跟踪 检测，结果表明，在保存过程中火菇素的活性逐步降低，同时其二级结构也 被破坏，火菇素比较容易长期保存。3 } 火菇素经SDS．PAGE后，进行胶内原位酶切，利用MALDI—TOF—MS分 析肽指纹图谱得到12个大小不同的肽段，检索NCBI蛋白质数据库，知火菇 素为～新蛋白。 为阐明火菇素蛋白的结构与功能的关系并揭示抗癌机理，使其更好地发 挥I脑床作用，用多种光谱测定了火菇素的构象。包括紫外光谱、红外光谱、 圆二色谱、显微共焦拉曼光谱等，并用蛋白质二级结构解析程序分析了火菇 r 素的溶液二级结构。f火菇素的紫外吸收结果表明，其最大吸收波长在 276．278tun处，最小吸收波长在249．252 nlTl处；红外吸收图中，在3300、2900、 1650、1500、1400cm。处出现数个强吸收峰。火菇素远紫外圆二色性的研究 表明。其水溶液在208rim处表现为宽大负峰，最大平均残基摩尔椭圆度 [o】208=-6574 deg．cm2．drool～，在223 nm处为肩，经二级结构解析程序计算分析 火菇素的二级结构和二硫键和芳香氨基酸对火菇素圆二色性的贡献分别为 77．4％和22．6％，二级结构的组成为：Q一螺旋19．7％，B一折叠和0一转角 50．1％，无规卷曲和y一转角30．2％，火菇素二级结构对pH，SDS和乙醇有一 II 定的稳定性，在pH 定的稳定性，在pH 4．6-9．4范围内，火菇素的结构几乎不发生变化，但在碱 性太强的环境中火菇素发生不可逆变性，火菇素对热变性很敏感，热变性几乎 使所有的二级结构都遭到破坏，转化为无规卷曲。显微共焦拉曼光谱也定性 地分析了火菇素中的a一螺旋、13一折叠和13一转角、无规卷曲等二级结构。 用紫外差光谱和荧光光谱技术对火菇素的酪氨酸微区进行了研究，结果 表明火菇素表现典型的酪氨酸残基紫外275nm吸收峰， ￡。。x=20322 L·mol。·cm～，紫外差光谱滴定发现，当pH在10．1和12．5之间时，差光谱 吸收△,4294 4。。与pH变化相关性明显，其酪氨酸表现离解常数pK,’=11．4， 荧光研究表明，火菇素不含色氨酸而只表现出酪氨酸荧光，在激发波长为280 nm时最大发射波长为305 11／11，pH和SDS对其荧光性质有较大的影响；KI 几乎不能猝灭火菇素的荧光，