活性GlmU在分枝杆菌中生长必需性及其缺失后对细胞壁完整性影响的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：型竺童叠!} } 签字日期：竺耳年互月驾日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 论文作者签名： 签字日期： 盈器；一耷三 √型彳 指导教师签名： 活性GlmU在分枝杆菌中生长必需-胜及其缺失后对细胞壁 活性GlmU在分枝杆菌中生长必需-胜及其缺失后对细胞壁 完整·|生影响的研究 博士研究生： 张文利 辛旨导教师： 马郁芳教授 指导小组： 辛毅教授 Micheal McNeil教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis,Mtuberculosis)是引起结核病的病 原体。目前由于该病原体和HIV的协同作用以及多重耐药菌株的出现，使曾被 有效控制的结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势，因此，目前寻找新一代 的、能有效对抗这种病原体的药物已成为试图控制这种疾病蔓延研究的中心。 细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础，其核心结构mAGP(mycolic acid， arabinogalactan，peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯糖半乳糖及肽聚糖三种成 允组成，其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖(arabinogalactan，AG)通过二糖连接 分子(L．鼠李糖．D-N．乙酰葡萄糖胺)共价连接到肽聚糖大分子上。在肽聚糖和二 糖连接分子中共有的组成成分是N一乙酰葡萄糖胺，影响它合成的因素都是寻找 药物理想的靶向分子。 N．乙酰葡萄糖胺合成过程是一系列的酶促反应过程，其中glmU(Rvl018)是 一种双功能酶，在其中催化了两步连续的反应，其一为催化1，磷酸．葡萄糖胺生 成1．磷酸．N．乙酰葡萄糖胺；其二为催化1．磷酸．N．乙酰葡萄糖胺生成终产物 UDP-N一乙酰葡萄糖胺。 本课题利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构，但生长快速且无致病性的耻 垢分枝幸1：菌(Mycobacterium smegmatis，Sm)mc2155菌株作为实验模型，以glmU 基因作为研究对象，并采用基于同源重组的插入突变方法使glmU基因发生突 变。目的是用基因敲除的方法证明结核分枝杆菌中glmU基因是分枝杆菌生长过 程中所必需的基因，并对gtmU基因敲除菌株进行了一系列的表型变化观察及细 胞壁结构的聚糖组成成分分析，从而证明glmU基因在分枝杆菌生长过程中具有 重要作用，这将为其作为研发抗结核新药的靶标提供有力的证据。 1 本论文获得以下结果： 本论文获得以下结果： 1．SmglmU基因的扩增和克隆 从TIGR基因数据库(丛!卫：丛坠坚塑：鱼g!：Q!g』!d蚴获得M smegmatis rodl55菌株 的glmU基因的核苷酸序列。根据Sm glmU基因的核苷酸序列设计引物，用高保 真LA Yaq DNA聚合酶从mc2155基因组中扩增Sm glmU基因及其上游约500 bp 的DNA序列，并将其克隆到pMDl8．T的克隆质粒上，用BcaBEST测序引物和 M13引物对Sm glmU基因的两端进行DNA序列测定，将测序结果与已知的Sm glmU基因进行相似性比较，得到与me2155基因组上胁glmU基因序列完全一 致的克隆质粒。 2．条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm glmU：：Kan8的构建 将来自于质粒pUC4K的Kan“克隆到Sm glmU基因内部，产生Sm glmU：：Kan8突变基因。将砌T glmU：：Kan8突变基因克隆到pPR27-xylE质粒，构 建出条件性复制质粒pPR27-xytE—Sm glmU．’：Kan8。pPR27携带温度敏感型复制 子，该质粒在30。c条件下可以复制，在42。C条件下不能复制。pPR27携带的 sacB基因为负选择标记，该基因表达产物蔗糖6一果糖基转移酶(Levansucrase)能 够分解蔗糖，产生对细菌生长有害的聚果