生物制药 RNAi教材编辑.pptVIP

第七章 RNAi;梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。;哺乳动物细胞中的 RNAi 现象;提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）;一、RNA干扰的发现 ;一、RNA干扰的发现 ;1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。 ;Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) ;一、RNA干扰的发现 ;二、RNA干扰的机制 ;基因沉默;RNAi的作用原理;1. siRNA的产生;;2. siRNA介导mRNA降解;;3. RNAi 的 特异性和高效性;Cap;RNAi机制 ;RNAi的放大效应机制;Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.;①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性； ③只有dsRNA才能诱导产生RNAi； ④只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰； ⑤注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解； ⑥RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；;二、RNA干扰的机制 ;;;;利用生物学软件组配长链 oligo，（合成单链DNA（直接带有4个bp的酶切位点粘性末端)；载体构建： dsDNA形成：annealing 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾;RNAi主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路 。;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;三、RNA干扰的应用 ;;Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls. ;三、RNA干扰的应用 ; 4.RNAi在整形外科领域的应用前景已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。 最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNA