生物化学和 分子生物学3教材编辑.pptVIP

重组DNA技术;基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术 直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学等。 对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术; ; 现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产???了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。 ;;基因工程的应用;重组DNA操作一般步骤：;DNA重组的基本模式; ;(分)------目的基因及载体的分离;化学合成;化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。 ;基因组文库;基因组文库; 细胞内总DNA的提取分离程序;组织或细胞染色体DNA;cDNA文库; 比较基因组文库与cDNA文库 ;将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术 PCR(Polymerase?chain?reaction)--聚合酶链式反应 分子生物学，医学，考古，法医 美国Mullis教授1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖;聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）;Polymerase Chain Reaction;载体DNA的选择;质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……;质粒载体的一般结构;DNA重组的基本模式;切------限制性内切酶酶切;载体和目的基因的切断;DNA重组的基本模式;接------载体和目的基因的连接;载体DNA与目的基因的连接;（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 ;（三）人工接头连接法： 将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段,约10~20个核苷酸， ）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。;DNA重组的基本模式;转------重组体的转化;宿主菌或受体细胞;原核细胞的转化（细菌转化）;感受态细胞（competent cell）;大肠杆菌细胞;E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。;真核细胞的转染;电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。;磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。;基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。 激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。 显微注射法：利用毛细管直接将DNA注入细胞内。;脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。 多聚物介导法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀