生化大实验 实验五 Folin–酚试剂法测定蛋白质含量课程设计.pptVIP

* * 实验五 Folin – 酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质含量 【原理】 用于蛋白质测定的Lowry反应是双缩脲方法的发展，蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸，在碱性条件下其肽链与Cu2+螫合，形成蛋白质 - 铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸 — 磷钨酸还原，生成蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。 利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1％）、三氯乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0．5％）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠 — 氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。 进行测定时，加 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏试剂仅在酸性 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 10的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 - 蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。 【操作步骤】 各管混匀后加入5mL试剂甲，混匀，于37℃放置10分钟。再加入0.5mL试剂乙（Folin氏试剂），立即振摇均匀，在37℃保温30分钟，然后于500nm或650nm比色测定。以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 【试剂】 1.标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，配制成250μg/mL的溶液。 2. Folin - 酚试剂的配制（均用分析纯试剂）： 试剂甲：由下述四种溶液配制，（1）4％碳酸钠（Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠溶液；（3）1％硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液；（4）2％酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配成碳酸钠 — 氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜 — 酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50： 1的比例混合， 即为Folin — 酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 *