基于蛋白质组学研究的阿维菌素发酵过程优化.docVIP

基于蛋白质组学研究的阿维菌素发酵过程优化 研究背景 1.1.阿维链霉菌 阿维菌素的产生菌是Streptomyces avermitilis,该菌株是1975年日本北里研 究所从日木静岗县地区的一个土壤样品中分离得到的。初期研究就发现该菌株的 培养液具有很高的驱肠道寄生虫活性。后来这株菌株被送到美国默克公司做进一 步独立研究，经100多位研究人员几年努力终于分离出这组具有驱虫活性的物 质，并将其命名为Avemectinso 阿维链霉菌是一种具有丝状分枝的单细胞原核生物。细胞结构与细菌相似， 具备细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等基木结构。革兰氏染色呈阳性。细胞壁主 要成分为肽聚糖。细胞膜含有种类十分丰富的载体蛋白，在营养吸收方面发挥着 重要作用。细胞质主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类、无机盐和大量的水分，最 重要的颗粒状内涵物是核糖体，此外还有多聚磷酸盐、类脂及多糖等内涵物。细 胞核同细菌一样，都为拟核，为一条共价、闭合、环状、以超螺旋形式存在的双 链DNA分子。在快速牛长的细胞中，核质体DNA可占细胞总体积的15-20%o 1?2?阿维菌素 阿维菌素是一种大环内酯类抗生素，其含有8个组分Ay Alb, A2a, A2b, BJa, BIb, B2a, B2b,在8个组分中，B组分的活性优于A组分，尤其Bw组分活性最强。 阿维菌素主要存在于菌丝体中，有许多因素要影响其牛物合成。如碳源、氮 源、无机盐、维生素、微量元素、通气量、温度和pH值等等。该抗生素发酵是 一个典型的休止一一增值动态曲线，菌种在第2?3天停止增长，后再开始合成阿 维菌素。 由于传统农药存在高毒、抗药性及环境污染等问题，以阿维菌素为代表的生 物农药，因其高效、低毒、高选择性以及与环境相容性好等特点，受到农药界的 高度垂视，该产品的生产呈快速上升的趋势。阿维菌素及其衍生产品的发展速度 和生物农药、兽药、医药的使用率及销售利润率逐年提高，也引起国内研究部门 和制药企业的高度重视。01975年发现阿维菌素以来，将近30年实验研究，工业 化推广生产，使生产工艺不断完善，国外阿维菌素发酵单位已突破10000U / ml 以上（HPLC测定）。而国内阿维菌素工业化牛产将近10年，发酵单位一般在2000? 4000u / ml,发酵罐规模在30?120m。 但随着屮国产量大幅提升，阿维菌素原药的价格大大下降。由于国外公司停 产，欧美H农牧产品进口质量标准提高，迫使中国耍淘汰大量有毒有机农药，加 大生物农药使用量，使得阿维菌素从2004年初逐步提价。因此优化阿维菌素发酵 过程，有着重大的意义。 1?3?阿维菌素发酵过程中细胞蛋白质组分析 对于一个生物个体来讲，虽然所有细胞的基因组成是相同的，但在不同的细 胞、同一细胞的不同分化阶段和同一细胞受到不同的外界刺激时，有关基因的表 达和蛋白质的功能都有所不同。研究两种处于不同状态的细胞在基因表达上的差 异,有助于了解基因和蛋白质的功能。有些DNA或RNA的改变，并不影响其编 码的蛋白质的功能。而口某些蛋白质合成后经修饰才能呈现功能，所以从蛋白质 水平找差异分子更为准确直接。通过双向凝胶电泳研究，比较研究体系内的不向 状态的蛋白质表达图谱，定量分析各蛋白质的变化，可对菌体内复杂的代谢、调 控等生物功能进行动态监测。 现今研究蛋白质的差异表达主要有两种方法，即双向凝胶电泳和噬菌体抗体 库技术。等电聚焦技术和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的结合就是双向凝胶电泳 技术(two-dimensional gel electrophoresis 2-DE)。将两种组织或细胞的蛋口质样品 在完全相同的条件下进行双向凝胶电泳分离，比较凝胶上的蛋白质分布，就可以 找到差异表达的蛋白质点。然后在双向凝胶电泳计算机自动软件辅助下，对蛋白 质样品进行分子量或末端约16个氨基酸序列测定，从而分析不同蛋白质的差异表 达。这种方法不仅可以将细胞或组织的全蛋白质成分进行分离和比较，也可以将 某一类蛋口质进行分离和比较。若结合超速离心技术可以进行细胞膜蛋口质的分 析，述可以在分离前将细胞全蛋白质成分或某一类蛋白进行同位素标记的磷酸化 反应，然后进行分离，放射自显影后，得到的图谱为所有被磷酸化的分子，这类 分子的表达差异可能在细胞信号传递中具有更重要的意义。 发酵是一种很复杂的生化过程,其好坏涉及诸多因素。除了菌种的生产性能, 还与培养基的配比，原料的质量，灭菌条件、种子的质量、发酵条件和过程控制 等有密切关系。因此，不论是新，老品种，都必需经过发酵研究这一关，以考查 其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。发酵过程优化的实质是 代谢流优化的过程。通过双向电泳技术这一蛋白质组学的主要硏究工具，可以对 不同吋期，不同批次的样品进行研究，再对实验结果进行分析后，可以更深入更