双报告基因原理.docxVIP

双报告基因原理 　　荧光素酶报告基因　　Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤　　火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。　　双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。　　Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。　　应用原理　　转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。　　工作流程　　用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。　　设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。　　筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。　　扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。　　培养293，并接种于24孔板中，生长10-24小时。　　将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。　　提取蛋白并用于荧光素酶检测。　　加入底物，测定荧光素酶的活性。　　计算相对荧光强度，并与空载对照比较。　　荧光素酶报告基因　　原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。　　步骤：　　(1)铺细胞于24孔板中，{选用48孔板，铺板密度约为30%。}每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞融汇度达到70%、85%时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染。转染体系的配置：目标蛋白的质粒，luc质粒，fermentas转染试剂，这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。　　脂质体法　　在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基为细胞换液。【对转染后易死的细胞可用不含双抗但含有10%FBS的DMEM或1640培养基】　　根据细胞培养皿的大小，按下表配制转