集胞藻PCC6803中基因slr2049功能的初步分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要藻胆蛋白是存在于蓝藻、 红藻和隐藻中的一类结构相似的捕光色素蛋白，藻 蓝蛋白是其中的一种，由此可见，藻胆蛋白在藻的光合作用过程中起着至关重要 的作用。目前，我国的水环境富营养化情况严重，而造成这一现象，很多藻类都 有不可脱卸的责任；另外，现在有很多研究表明藻胆蛋白也极具商业价值。因此， 研究清楚藻胆蛋白的合成过程不仅对水环境的保护和改善有着十分重要的意义， 并且能够带来不小的经济效益。藻胆蛋白是由藻胆色素与相应的脱辅基蛋白以硫 醚键共价结合而成。在体内，藻胆蛋白生物合成的最后一步，藻胆色素与脱辅基 藻胆蛋白的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。最早被发现和研究的 藻胆蛋白裂合酶基因 cpcE 和 cpcF 是在聚球藻 Synechococcus sp. PCC7002 存在的， 而这两个基因在不同的藻种间有比较高的同源性。近些年有很多与蓝藻中色素裂 合酶基因相关的报道，例如，2006 年，Zhao 等在鱼腥藻 Anabaena sp. PCC 7120 中发现了一种色素裂合酶基因 cpeS (编号为 alr0617)，该基因编码的色素裂合酶 CpeS 可以催化藻蓝胆素(PCB)连接到藻蓝蛋白或者藻红蓝蛋白的β亚基 Cys-84 位 点上。本实验通过同源分析软件在集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中找到了与 cpeS 同源性较高的基因，编号为 slr2049。为了研究该基因所编码蛋白是否具有与 其同源蛋白 CpeS 具有相同或者相似的功能，从集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 的全基因组中克隆出能够在大肠杆菌中合成具有荧光性的藻蓝蛋白β-亚基的 3 个 相关基因：血红素加氧酶 1 基因 (ho1)，藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)以及 脱辅基蛋白β亚基基因 (cpcB) 。构建了表达质粒 pCDF-cpcB-slr2049 和 pET-ho1-pcyA，然后在大肠杆菌 BL21 体内对 PCB 和藻蓝蛋白-β亚基进行了异源 体内重组，并对重组产物进行了光谱测定。SDS和光谱测定的实验结果表 明，基因 slr2049 所编码的蛋白具有色素裂合酶的作用。另外，为了进一步研究基因 slr2049 编码蛋白的功能，本实验还对该基因进行 了定点突变，构建了两个突变体 slr2049(W14L)和 slr2049(Y132S)。同样将这两个 突变体进行异源体内重组，对重组产物进行了光谱测定。SDS和光谱测定 的实验结果表明，突变体 Slr2049(W14L)仍具有催化活性，但是其催化能力很低； Slr2049(Y132S)的催化活性相对而言降低的较少。由此可推断，该蛋白的第 14 位色氨酸对其催化能力有积极作用，而第 132 位的酪氨酸对其催化能力没有很大的 影响。关键词：色素裂合酶，藻蓝蛋白-β亚基，体内重组，定点突变AbstractPhycobiliproteins are a homologous family of light-harvesting chromoproteins existed in cyanobacteria, red algae and cryptophytes, and of which phycocyanin is the one. It follows that phycobiliproteins play a very important role in the process of the photosynthesis. At present, water eutrophication is one of the severest pollutions in our country, and many kinds of algae should be responsible for that problem. Moreover, phycobiliproteins have commercial value according to some recent studies. Therefore, to do in-depth research on the biosynthesis pathway of phycobiliproteins is not only good for the environmental protection and enhancement, but also is a big economic benifit. Phycobiliprotein is made up of phycobilin and its corresponding apophycobiliprotein, and they are