鸡CD4基因片段的原核表达与单克隆抗体制备-预防兽医学专业论文.docxVIP

中文摘要 CD4 分子是 T 淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是 T 淋巴细胞重要的表面标 志。鸡 CD4 基因定位于 1 号染色体，基因全长 11.5kb，共有 10 个外显子。鸡 CD4 基因编码的成熟蛋白包含由四个类免疫球蛋白的胞外区（402 个氨基酸），一个疏水 跨膜区（24 个氨基酸）和一个较长的胞浆区（33 个氨基酸）组成。 CD4 分子主要存在于辅助性 T 细胞、调节性 T 细胞、单核细胞、巨噬细胞和树 突状细胞表面。CD4 分子作为辅助受体参与 TCR 对 MHCⅡ类分子递呈抗原的识别。 CD4 还是一类信号传递受体，分子胞内部分通过酪氨酸激酶途径参与经 TCR 介导的 信号级联反应，引发一系列的免疫应答。鸡和哺乳动物的 CD4 分子在结构和功能上 的保守性很高，这些保守性与鸡的免疫系统紧密相关。为建立鸡 CD4 分子的检测方 法，进一步研究其基因结构及其生物学作用，本研究进行了鸡 CD4 分子基因片段的 原核表达、单克隆抗体制备和单抗的免疫学活性鉴定。 首先，参照 GenBank 中已经登录的鸡 CD4 cDNA 序列，以及 pET-32a 载体多克 隆位点序列设计了一对引物。利用 PCR 技术扩增了鸡 CD4 分子中去除信号肽的 N 端 2 个免疫球蛋白样区基因片段。其大小为 579bp，与 GenBank 中登录的鸡 CD4(登录 号：Y12012)的序列进行比对，结果完全一致。将其插入表达载体 pET-32a，获得了 重组表达载体 pET-32a-CD4。将此重组表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)，优化表达 条件后进行诱导以大量表达目的蛋白。裂解诱导培养的菌体纯化包涵体，包涵体再经 过体外溶解、复性后经 Ni-NTA 纯化介质纯化得到了 His-CD4 融合蛋白，符合预测结 果，大小约为 42KD。表达产物经 His-NTA 树脂亲和层析柱分离纯化，得到了纯度较 好的鸡 His-CD4 融合蛋白。 其次，将纯化后的 His-CD4 融合蛋白免疫 8 周龄的 Balb/c 小鼠。经 4 次免疫， 血清抗体达到 1：10000 以上，取免疫小鼠的脾细胞与 SP2/0 细胞融合。经多次亚克 隆和细胞上清液中抗体检测，获得一株阳性杂交瘤细胞株，命名为 3E12。Western-blot 实验结果显示，该细胞株上清液的抗体与目的蛋白发生特异性反应。将该细胞株注射 Balb/c 小鼠腹腔，制备腹水，腹水抗体的间接 ELISA 效价为 1:105。用试剂盒鉴定的 单抗的免疫球蛋白亚类为 IgG2b。 综上所述，本研究在成功克隆鸡 CD4 基因片段的基础上，构建了表达重组载体 pET-32a-CD4 质粒，并表达获得了目的基因的融合蛋白。通过细胞融合制备了稳定分 泌特异性针对目的蛋白单抗的细胞株，并对单抗效价和亚类做了鉴定。本研究为鸡 CD4 生物学作用的进一步研究提供了材料。 关键词：鸡，CD4，原核表达，单克隆抗体 I A Abstract CD4 is type I transmembrane glycoprotein found on subsets of T cells as well as an important T lymphocyte surface markers. Chicken CD4 gene is located chromosome 1, its total length is 11.5 kb including ten exons. Chicken CD4 gene encodes a mature protein containing four immunoglobulins-like, extracellular region (402 AA) Transmembrane region (24AA) and cytoplasm region (33AA). CD4 acts as co-receptors for the T cell receptor (TCR) in recognition of antigens associated with MHCⅡ molecules. CD4 is also a receptor of signal transmission. The cytoplasmic region of CD4 through tyrosine kinase pathway is involved in signaling cascades mediated by TCR, triggering a series of immune response. There is highly conserved in the stru