王镜岩生物化学经典课件5核酸化学考研必备学生物化学必备.ppt

一、核酸的分离、提纯和定量测定 三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g DNA分子的变性 四、核酸的变性，复性及杂交 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G+C)%， 或GC%=（Tm-69.3）×2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大。 4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。 SSC溶液，常用于DNA的溶解。 (二) 复性 T1/2 × C ＝ const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素 1.DNA的片段越大,复性的速度越慢; 2.DNA的浓度越高,复性的速度越快; 3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快; 4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低; 5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。 DNA复性与Cot分析 当 C/C0=1/2时， k=1/C0t1/2 哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。 人DNA的Cot曲线 (三) DNA的分子杂交技术 分子杂交是将不同来源的核酸分子分别变性，再混合后复性，使不同来源的单链的互补区形成双链的技术。 通常将其中的一方用放射性同位素或特定的基团(如生物素,地高辛)标记，称作探针，现时的探针多为人工合成的短片段。 若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交，称作点杂交。对组织切片或菌落进行处理后再杂交称作原位杂交。 分子杂交的广泛应用是将样品DNA用限制性内切酶切割成一定大小的片段，进行变性凝胶电泳，将凝胶电泳形成的DNA区带转移到膜上再进行杂交，这种技术称作Southern杂交。将RNA凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作Northern杂交。将蛋白质凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作Western印迹技术。将蛋白质等点聚焦形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作Eastern印迹技术。 分子杂交技术在现代生命科学中的应用十分广泛。 将人工合成的探针用点样机点到玻璃或塑料基片上形成高密度的阵列，将样品DNA用限制性内切酶切割成一定大小的片段，变性后用荧光基团标记，再进行分子杂交操作，这就是DNA芯片技术的基本原理。用类似的技术可以制成蛋白质芯片。按指令在基片上合成探针，可以制成密度特别高的芯片。 生物芯片技术有非常广阔的应用前景。 基本要求 1.熟悉核酸的水解方法及水解产物。 2.掌握核酸的酸碱性质。（重点） 3.掌握核酸的紫外吸收。（重点） 4.掌握核酸变性、复性及杂交的有关知识及应用。（重点、难点） 第15章 核酸的研究方法 (一) DNA的分离 用1mol/L的NaCl制备组织匀浆,离心除去组织残渣,多次用苯酚处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,最后加2倍体积的乙醇沉淀出DNA。 (二 ) RNA的分离 由于RNA酶存在广泛,且十分稳定,破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA酶,试剂要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC处理,多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,mRNA可用寡聚dT-纤维素亲和层析从总RNA中分离。 (三) 核酸含量的测定法 常用的方法是测定260nm的消光度,用公式计算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法测定。 DNA的含量可以用二苯胺显色法测定。 RNA的含量可以用地衣酚显色法测定。 双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。 稳定双螺旋结构的作用力为氢键、碱基堆积力（即疏水作用）和环境中正离子的作用。 碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。 5.DNA双螺旋分子结构的不同类型： 主要有三种，分别命名为A、B和C型。其中B型与Watson-Crick提出的模型一致，A和C型在低相对湿度的条件下形成，它们的螺距都比B型要短，A型DNA的结构