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碱裂解法提取质粒DNA 作者：巩微 班级：2008级生技班 学号：200805140045 【摘要】实验采用碱裂解法从大肠杆菌中提取pUC19质粒，利用酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂按照不同成分及配比、加入RNase对提取物进行纯化，并对比纯的pUC19质粒、λDNA等样品DNA提取物进行电泳、染色、成像分析。对应实验结果找到pUC19质粒DNA的条带，并对有无加入酚提取蛋白质杂质、加入RNase及未加RNase消除RNA影响分别做了对照实验。 【关键词】碱裂解 质粒 纯化 电泳 1．原理 1.1 碱变性法提取质粒DNA原理 在不同pH值溶液中，质粒DNA与染色体DNA变性与复性的性质不同。在pH值高达12.6的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的醋酸钾（或钠）高盐溶液中和碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复到原来的超螺旋结构并溶解于溶液中；染色体DNA不能复性，而是形成缠连的网状结构。染色体DNA与不稳定的大分子DNA、蛋白质-SDS复合物等，通过离心沉淀而除去。溶于上清液中的质粒DNA，利用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase酶以及一些可溶性蛋白，通过苯酚氯仿抽提而除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。（加入各溶液的实验现象与作用原理见表2.1.1） 溶液Ⅰ（50mM葡萄糖/25mM Tris-HCl/10mM EDTA/pH=8.0） 溶液Ⅱ（0.2mM NaOH/1%SDS/pH=12.6左右，现用现配） 溶液Ⅲ（5mM KAc 60mL/冰醋酸11.5mL/重蒸水28.5mL/pH=4.6） 1.2 质粒DNA纯化原理 表2.2.1 质粒纯化过程中加入试剂的作用 加入试剂 作用效果 酚 蛋白质变性剂，使蛋白质变性沉淀 氯仿 抽提蛋白质 异戊醇 蛋白质变性剂，同时防止泡沫过多，最终离心管中形成界面，更易观察 ?NaAc溶液 调节TE溶液的盐离子浓度，中和部分DNApH8.0时带的大量负电荷，其更易沉淀 RNase 除去与质粒DNA同时沉淀下来的RNA 1.3 琼脂糖凝胶电泳进行DNA的分离纯化原理 电泳（electrophoresis）是带点物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可利用于分离、鉴定和纯化DNA片段。 凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。 当琼脂糖加热至90℃左右，即可熔化成清亮、透明的液体，浇在模上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40-45℃。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率略低，但它的分离范围更大（50-百万bp），小片断DNA（50-20000bp）最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，即测定DNA的分子量，分离经限制酶水解后的DNA片段，进一步纯化DNA等。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速率与样品DNA分子大小、DNA构像、琼脂糖浓度等因素有关。 2．实验 2.1 pUC19质粒的提取 （1）筛选含有pUC19质粒的大肠杆菌。 由于pUC19质粒中含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），能够在加入Amp的选择培养基上生长的大肠杆菌细胞中便可证明转入了pUC19质粒DNA，且可以将其从中提取出来。为了大量提取质粒DNA，需要转接大肠杆菌使大多数细胞处于对数生长期以获得足够数量的细胞。该实验中使用20ml LB液态培养基（胰蛋白胨(Tryptone) 10g/酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 5g/L），加入40μL Amp（80μg/mL LB培养基，100μg/μL Amp），混匀后在无菌环境中挑取选择培养基上的大肠杆菌菌落接种于LB培养