慢性砷中毒对雄性SD大鼠生精上皮的影响-人体解剖与组织胚胎学专业毕业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2013 届硕士研究生学位论文 PAGE PAGE 10 关键词：砷中毒；精子；透明质酸酶；睾酮；抑制素；凋亡； 1 前 言 慢性砷中毒已成为一个全球性的危害人类健康的大问题，大多是因饮用含砷 量高的水以及燃烧含砷量高的煤引起。而我国是受慢性砷中毒危害较严重的国 家，尤其是贵州的黔西地区，是慢性砷中毒的高发区。有研究表明，过量砷化物 可通过对生殖系统多方面的影响造成男性生殖系统损害，如生精细胞和精子受 损，精子数量减少、质量下降、活动力减弱、畸形率增加，凋亡率增多等等。因 而近年来，砷的生殖、发育毒性越来越多的引起国内外的关注。 聂继盛等[1]研究表明接触组男性血砷及精液砷含量增高，而这二者具有很强 的相关性，说明砷可通过血睾屏障对男性生殖细胞产生损害。陆祥等[2]研究初步 证实生精细胞凋亡增加是砷致生殖系统毒性的作用途径之一。作为顶体反应中的 关键酶之一，透明质酸酶（HYD）在精子受精过程中起着重要作用，它的活性也 是评判精子功能的重要指标之一。王珂等[3]对人类精子透明质酸酶进行深入研 究，但对于砷中毒雄性大鼠精子透明质酸酶活性的研究，国内外仍未见报道。近 年来，新的研究提出，砷化物是一类潜在的环境雌激素 (envrionmental estrogen ,EEs)物质[4-5]，环境雌激素可影响人类的内分泌系统、神经系统、生 殖和发育，更重要的是可以引起雌激素依赖器官和多种非雌激素依赖器官的肿瘤 [6-7]。进一步研究显示砷对所有类固醇受体途径具有相似的效应[8]。这些受体途径 不仅包括糖皮质激素受体而且包括雌激素、孕酮、睾酮、盐皮质激素受体及甲状 腺激素受体[9]。 EES 通过雌激素受体(ER)作用于下丘脑和垂体，影响垂体激素及 其调节因子的产生和释放[10]。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)可刺激垂 体分泌黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。LH 主要作用于睾丸间质细胞 （Leydig cell），与间质细胞膜受体结合后，引起并维持间质细胞产生睾酮;FSH 主要作用于睾丸曲精小管生精上皮中的支持细胞（Sertoli cell）,产生雄激素 结合蛋白(ABP)和抑制素（inhibin）。促性腺激素间相互作用，睾酮与 LH 间存在 负反馈调节，抑制素与 FSH 间也存在负反馈调节。 Sarkar 等研究显示砷暴露对 精子发生和促性腺激素及睾酮分泌有抑制作用[11]，但砷对血清抑制素 B（INH-B） 的影响仍未见报道。本实验通过建立慢性砷中毒的大鼠模型，应用常规的组织学 HE 染色观察睾丸组织形态学变化、透射电镜和扫描电镜观察睾丸和精子超微结 构的变化、流式细胞术和 TUNEL 法观察精子和生精细胞凋亡、改良底物膜法测精 子透明质酸酶活性变化、以及检测血清睾酮和血清抑制素 B 的浓度变化，并进行 图象分析、计数、平均值和平均灰度值的测定，从血清雄激素、细胞凋亡、酶活 性等的角度探讨慢性砷中毒对大鼠生殖系统损伤的机制，以期为砷中毒所致生殖 系统损伤发病机理提供重要的形态学依据，并为慢性砷中毒的防治提供科学依 据。 2 材 料 与 方 法 2.1 材料 2.1.1 动物分组：清洁级 SD 雄性大鼠 40 只，体重 100-120g（由重庆腾鑫比尔 实验动物销售有限公司提供）适应性喂养一周后，随机分为高剂量组、 中剂量组、低剂量组、对照组 4 组。染毒组用三氧化二砷(As203)溶于 蒸馏水中自由饮水染毒，高、中、低剂量组分别给予 10.0mg/(kg·d)、 5mg/(kg·d) 、2.5mg/(kg·d)（以砷计）喂养，对照组自由饮用蒸 馏水水，每周称体重，调整药物剂量，连续喂养 9 个月。 2.1.2 药品、主要试剂及仪器 As203（贵阳医学院药学综合实验室提供），1%饿酸 (唐和唐生物科技有限公 司)，3%戊二醛(武汉瑞基化工有限公司),透明质酸钠（山东福瑞达生物化工有限 公司），明胶（成都化学试剂厂），细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程公 司),INH-B ELISA 、T ELISA 试剂盒(武汉华美公司)，异硫氰酸荧光素（FITC） 标记的 Annexin-V 细胞凋亡试剂盒（美国 BD 公司）。 LeicaDME 光学显微镜(上海枫立仪器有限公司)，HITCHI S-3400N 扫描电镜 (日 立），HITCH E-1010 离子溅射仪（日立）。流式细胞仪 FACSCalibur（美国 BD 公 司） 2.2 实验方法 2.2.1 建立慢性砷中毒模型 清洁级 SD 雄性大鼠 40 只，体重 100-120g 适应性喂养一周后，随机分为对照组， 低剂量组，中剂量组及高剂量组 4 组。染毒组用三氧化二砷(As203)溶于蒸馏水中 自由饮水染毒，高、中、低剂量组分别