黄粉虫酪氨酸羟化酶原核表达、活性测定及其在黑化过程中的作用-动物学专业毕业论文.docxVIP

/ ㈣煳剃 ㈣煳剃{Y1 909748 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、 中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在丑年量月解密后适用本规定。 非涉密论文日 论文作者签名： 童』也逸日 期：丝!』：垒：』里 导师签名： 黄粉虫酪氨艘羟化酶原核表达、活性测定及jen：黑化过程中的作用 黄粉虫酪氨艘羟化酶原核表达、活性测定及jen：黑化过程中的作用 中文摘要 中文摘要 黑化反应在昆虫的表皮鞣化、色素形成以及免疫防御过程中起着重要的作用。 黑化反应是酪氨酸在酶的作用下首先羟化为3，4．二羟苯丙氨酸(DOPA)，然后 DOPA再在相关酶的催化作用下转化为儿茶酚类及其衍生物，最终形成色素的过 程。酪氨酸羟化成多巴的反应是黑化反应的限速步骤，可在两种酶的作用下进行： 酚氧化酶(phenoloxidase，PO，EC 1．14．18．1)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase， TH，EC 1．14．16．2)。其中PO广泛存在于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、蜚蠊目和直翅 目等昆虫的各个发育期，且对其研究较为深入。而对昆虫TH的研究则主要集中在 双翅目及鳞翅目类昆虫，尤以黑腹果蝇(伽s叩办妇小P肠甩馏珊陀，．)研究最深入， 对鞘翅目昆虫TH基因及其功能研究极少。对鞘翅目昆虫册基因及其功能研究较 少。 本研究以鞘翅目昆虫黄粉虫(死甩P6，．fD朋D，f，0，．)为研究对象，成功构建黄粉虫 酪氨酸羟化酶(TmTH)基因的原核表达载体，并表达出有活性的酶蛋白，利用高 效液相色谱法测定产物DOPA的含量，通过抑制TH酶活性，以P0作为参照，初 步探讨TmTH在黄粉虫黑化过程中的生理功能。为进一步研究鞘翅目昆虫的表皮 形成机理及免疫黑化打下基础，同时也为研究昆虫病虫害防治提供理论依据。本 实验主要内容及结果如下： l、黄粉虫酪氨酸羟化酶基因表达载体构建与原核表达：将砌掰编码区克隆 到表达载体pET28a(+)中，并在大肠杆菌BL21中进行了IPTG诱导浓度表达及诱导 时问表达，结果表明lmM IPTG诱导菌体表达5h时，表达出的蛋白量最大。经 SDS．PAGE分析以及westem．blot分析显示诱导表达出活性蛋白的大小约为62 kD， 这为进一步研究砌册体外酶学性质及相关功能等方面的研究提供材料。 2、高效液相色谱法测定产物多巴的含量：将原核表达出的活性TmTH以及黄 粉虫幼虫不同组织提取物的TmTH样品，在TmTH催化反应体系中反应10min， 用高氯酸终止酶反应，应用高效液相色谱紫外检测法测定反应生成的L．DOPA含 量，计算酶的活性。结果表明3ml原核表达菌体酶的比活性为10．028 U／mg，TH抑 中文摘要 中文摘要 黄粉虫酪氩艟羟化酶原核表达，活性测定及其在黑化过程中的作用 制剂3．碘．L．酪氨酸(3．iodo啊rosine，3IL)明显抑制了产物L．DOPA的生成。 3、抑制酪氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫血淋巴黑化及凝集功能的影响：幼虫 血淋巴与不同浓度的PO抑制剂PTU及TH抑制剂3IL混合反应，室温下拍照并 记录血淋巴的黑化时间变化，同时利用倒置显微镜拍摄黑化前后的血淋巴凝集状 况。结果表明3IL和PTU均有不同程度的抑制作用，且抑制效果随着抑制剂浓度 增大而越明显，其中3IL处理的血淋巴，其黑化时问稍微延长，且凝集块明显减 少。 4、抑制体内酩氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫表皮黑化反应的影响：配制含有 不同抑制剂浓度的生理液注射不同发育体色的黄粉虫末龄幼虫，观察记录注射创 口的黑化时间。选取白色幼虫进行注射，并记录其白色表皮发育为黄褐色表皮的 时间。剥离的白色幼虫表皮组织在不同条件下培养，进一步研究TmTH在表皮黑 化过程中作用，48h后倒置显微镜下观察表皮颜色变化。PTU和3IL抑制结果表明 PO和TmTH均参与了表皮色素沉着。 关键词：黄粉虫：酪氨酸羟化酶；原核表达；酶活性；黑化；抑制剂 作 者：刘晶晶 指导教师：许维岸 n 黄粉虫酪氨酸羟化酶原核表达、活忡测定及】e4；黑化过程中的作用 黄粉虫酪氨酸羟化酶原