黄芪多糖对尿路细胞免疫功能的调节作用研究-免疫学专业毕业论文.docxVIP

飞 中文摘要 中文摘要 英文摘要 研究论文 —1L—jL． 刖舌 材料 结果 附图 附表 讨论 结论 参考 综述黄 致谢 个人简历 中文摘要黄芪多糖对尿路细胞免疫功能的调节作用研究 中文摘要 黄芪多糖对尿路细胞免疫功能的调节作用研究 摘 要 目的：尿路感染(Urinary tract infection，UTI)是临床常见的感染性疾 病之一，女性较为多见。其已成为慢性肾功能不全的主要病因。然而，近 年来由于抗生素耐药的逐年增加，感染菌在尿路细胞内的长期定居以及机 体尿路免疫失衡等原因严重影响了单一抗生素治疗的效果，临床治疗出现 了困境，也增加了患者的身心痛苦。因此，寻找并开发抗生素以外的治疗 方案，是应对UTI的新策略。 尿路固有免疫是机体预防病原菌侵入的重要屏障，起着抵抗微生物的 防御作用。TLR4在尿路细胞固有性免疫中扮演重要角色，其在尿路主要 表达于膀胱上皮细胞和肾小管上皮细胞。TLR4与其配体结合后，可以通 过MyD88依赖或cAMP／CREB信号转导途径，活化尿路细胞，调节多种 细胞因子的表达，发挥抵抗细菌入侵，促进细菌排出等固有性免疫作用。 前期的临床调查研究已发现中药黄芪能够通过上调慢性尿路感染患 者TLR4的表达提高机体的免疫能力，提高治疗效果。而黄芪是多种化学 成分的混合物，黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)作为黄芪的主要成 分，也是TLR4的配体，其是否能够通过TLR4调节尿路粘膜免疫功能的 研究还鲜有报道。 本研究旨在将黄芪多糖作用于膀胱上皮细胞株5637细胞、肾小管上 皮细胞株A498、人单核细胞型淋巴瘤n口．1细胞及小鼠后，探索黄芪多 糖对尿路细胞TLR4表达、细胞因子的分泌、抗菌效应、与LPS的竞争 作用以及小鼠膀胱炎症反应强度的影响，进一步研究黄芪多糖调节尿路粘 膜免疫功能的机制，为尿路感染的免疫调节、治疗提供实验依据。 方法： 1 TLR4表达的检测：将不同浓度的黄芪多糖及黄芪多糖与LPS的混 合物分别与5637细胞、A498细胞、THP一1细胞共培养48小时，收集细 胞，流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达； 2 5637细胞的抗侵袭作用：不同浓度的黄芪多糖及黄芪多糖与LPS 的混合物刺激5637细胞48小时后，加入大肠杆菌U30共培养l小时， 中文摘要彻底洗去未侵入细胞的大肠杆菌，将侵入细菌的细胞用O．5％的 中文摘要 彻底洗去未侵入细胞的大肠杆菌，将侵入细菌的细胞用O．5％的 TritonX．100溶解，溶解液稀释后LB平板培养过夜，进行菌落计数； 3实时定量PCR检测细胞因子的表达：黄芪多糖作用于5637细胞、 A498细胞、THP．1细胞，以及感染模型小鼠膀胱和肾组织，提取总RNA， 反转录为cDNA，实时定量PCR测定IL．6、IL．8、n师．0t、MyD88的mRNA 表达。 4动物实验：8周龄Balb／C雌鼠随机分为2组，对照组和实验组， 每组15只。大肠杆菌U30株经LB液体培养基48小时静置培养，生理盐 水洗涤，以每只108CFU／509l的菌量，经小鼠尿道注入膀胱。感染6小时 后，对照组，腹腔注射生理盐水，1009l／只；实验组，腹腔注射黄芪多糖 注射液，每只200mg／kg，每天一次，共注射3天。 5膀胱内细菌的菌落计数：处死小鼠，将膀胱剪碎后用TritonX．100 溶解，溶解液稀释后涂布于固体LB平板培养基，37℃温箱孵育过夜，进 行菌落计数。 6制作感染小鼠膀胱、肾组织切片，HE染色，光学显微镜观察炎症 ’细胞浸润现象。 结果： 1黄芪多糖作用于5637、A498和THP．1细胞48小时后，三种细胞 表面TLR4表达均有显著增加。不同浓度的APS作用于5637细胞后，与 对照组相比，均z月‘匕l-,刺激TLIⅥ表达增加(PO．05)，但不同浓度间没有显著 差异(pO．05)；黄芪多糖与LPS混合后，仍可刺激TLR4表达增}Ill(P0．05)， 与APS单独刺激相比有显著差异(PO．05)，而与LPS单独刺激相比无显 著差异(pO．05)。APS以100Pg／ml的浓度作用A498和T唧．1细胞48小 时后，与对照组相比，也能显著刺激两种细胞TLR4表达上调(PO．05)。 2 5637细胞抗侵袭实验显示：APS以20I．tg／ml、100pg／ml作用于5637 细胞48小时后，U30细菌感染细胞，细胞内侵入的细菌数分别为 70．454-15．5，82．734-38．25，显著低于空白对照组234．94-1 15，(PO．05)，不 同浓度的APS与2¨∥ml LPS共同作用5637细胞，细胞内细菌数也显著 低于对照组，且随着APS浓度增高(20、100、500rtg／m1)，细胞内细菌 数呈下降趋势。 3 Real．tim