棉花DNA分子标记连锁图谱构建及基因定位-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究以陆地棉多标记基因系T582和T586为亲本，通过杂交获得的F2群体作 为构建棉花分子连锁图谱的作图群体，应用SSR和AFLP两种比较新颖的分子标记方 法进行了研究。通过反复实践和摸索，建立了棉花基因组DNA提取、PCR反应和DNA 多态性检测等技术体系：在国内首次构建了具有我国自主知识产权的棉花分子连锁图 谱框架，与此同时对若干基因进行了定位。具体研究内容概括如下： l棉花DNA提取方法的探讨 f提取植物基因组DNA有两种基本方法，即SDS法和CTAB法，在原方法基础上 ‘ 进行适当改进，常分别冠以改进(改良)的SDS法和改进(改良)的CTAB法。本文 以棉花不同部位的材料为研究对象，进行了四种提取DNA方法的比较研究，其中改进 的SDS法与原SDS法相比主要有三点不同：(1)．第一次取上清之前先用氯仿／异戊醇 (24：1)抽提一次，再用异丙醇沉淀；(2)．改高速离心得到DNA小丸为挑取絮状DNA； (3)．提取缓冲液中加入1—2％PVP。改进的CTAB法与原方法相比也有三点不同，其 中最主要的一点是：溶解于高盐溶液(1．4mmol／L NaCl)中的CTAB与核酸复合物， 不是采用降低溶液盐浓度(O．7mmol／L NaCI)的办法来析出DNA，而是直接采用加入 0．6．1倍体积的异丙醇的方法来获取可见的絮状DNA；另外两点改进之处与改进的SDS 法相同。实验结果表明：改进的SDS法和改进的CTAB法分别优于原SDS法和原CTAB 法，两种改进的方法对提取棉花基因组DNA有异曲同工之妙。DNA的得率不仅与提 取方法有关，而且与棉花取材的部位不同有关。改进的CTAB法DNA得率高于改进的 SDS法；棉花不同部位材料采用改进的CTAB法提取基因组DNA，其DNA得率的高 低依次为花药花瓣叶片纤维。由改进方法提取的棉花基因组DNA能完全双酶切， 满足SSR和AFLP等后续分子生物学研究的需要。而且两种改进的方法也适应于其它 植物基因组DNA的提取，其中改进的SDS法尤适于高蛋白、 因组DNA 的提取，而改进的CTAB法则适于多酚类植物基因组DNA 2棉花微卫星DNA标记技术的研究 f基于PcR反应的植物DNA多态性检测体系是现代植物分子标记研究的关键技术， ＼ 试验从微卫星DNA着手，对SSR．PCR反应条件和DNA多态性检测方法进行了优化 研究。试验结果表明：SSR—PCR反应，50对SSR引物极大多数引物最佳退火温度为 研究。试验结果表明：SSR—PCR反应，50对SSR引物极大多数引物最佳退火温度为 55。C，最佳退火时间为45s。就SSR而言，进行DNA多态性检测，聚丙烯酰胺银染检 测优于琼脂糖EB检测。聚丙烯酰胺胶的浓度需随着待测SSR序列的片段大小而作适 当调整，一般情况下聚丙烯酰胺胶的浓度以6％为宜，但当待检测的DNA片段小到 100bp．250bp的区域范围时，胶的浓度需提高到8％。胶板样品上样量以39l为宜。6％ 和8％浓度的聚丙烯酰胺最佳电泳时间分别为1．5h和2h。在显色液预置冰堆(约10。C) 的前提下，显色的时间应控制在4min之内，以便得到的胶板DNA条带强度适中、对 比度好。Y 3棉花亲本和杂交后代DNA多态性分析 ， f以陆地棉品种T582和T586两个多标记基因系及其杂交后代F1为研究材料，进 L 行微卫星DNA分子标记多态性分析，结果表明：50对SSR引物，在T582和T586及 其杂交后代F1之间具有DNA多态性的引物选出6对。这6对引物共获得SSR序列位 点63个，其中具有多态性的序列位点26个，占总位点的41．27％。SSR分子标记具有 高度的多态性和稳定性；多态性的SSR序列位点多数呈共显性标记，少数为显性标记。 明确了两个棉花材料之间具有DNA多态性的SSR序列为(CT)18、(CT)22、(CTA)20、 (CTT)20、(GA)20希I(GT)17。 应用AFLP分子标记技术，对陆地棉两个多标记基因系T582和T586及其杂交后 代F1等也进行了DNA多态性分析。结果表明：在58对EcoRI／MseI引物组合中，筛选 出4l对引物组合具有多态性，多态性的引物组合占筛选总组合的70．69％，可见AFLP 分子标记具有多态性位点的引物组合百分率远比其它分子标记SSR和RAPD等高得 多，即具有其它分子标记所无法比拟的高效性。AFLP分子标记具有高度的多态性，多 态性引物组合扩增的多态性条带占总扩增条带的百分比接近于SSR，非常适于基因组 差异较小的(棉花)材料之间的多态性筛选。采用聚丙烯酰胺银染法显带，AFLP进行 PCR扩增能看到30．80条DNA亮带，且检测灵敏度高，可区别只相差十几个bp甚至 几个bp大小的DNA片段。AFLP还具有稳定性好和适用范围广