黄芩多糖抗猪生殖和呼吸系统综合症病毒的研究-生药学专业毕业论文.docxVIP

复旦大学硕士学位论文黄芩多糖抗猪生殖和呼吸系统综合症病毒作用研究 复旦大学硕士学位论文 黄芩多糖抗猪生殖和呼吸系统综合症病毒作用研究 摘要 本研究由三部分组成：抗PRRSV中药的筛选、黄芩粗多糖抗PRRSV的研究和 抗PRRSV活性跟踪下黄芩粗多糖的分离纯化及黄芩多糖SP2基本化学性质的研 究。 一．抗PRRsV中药的筛选 本研究第一次建立了MARCl45一PRRSV一样品体系，用于筛选抗PRRSV中药。 为提高活性中药筛选的效率，在筛选过程中首次选择了能直观反映细胞状态的指 标，即细胞单层的长满程度，作为判断样品的细胞毒性和抗病毒活性的指标。 根据中药的性味、归经及其在临床上的应用，在常用和非常用的中药中进行 初步的选择。制备了单方中药及复方中药95％乙醇提取物、水提醇沉物和挥发 油样品共116份。 (一)样品的细胞毒性试验 在96孔细胞培养板中加入MARCl45细胞，10％长满时，加入含不同浓度样品 的DMEM培养基，培养96h后，观察各孔细胞的长满程度，判断各个中药样品的 细胞毒性浓度。 (二)样品降低病毒滴度试验 将按照Reed—Muench法测定TCID。。的病毒PRRSV溶液与不同浓度的样品混 合，共同作用30min，测定经样品处理以后病毒的TCI％，发现3个样品，尤其 是4a可以明显地降低病毒的TCID；。，即对病毒有直接的灭活能力。 (三)样品细胞内抗病毒试验 在96孔细胞培养板中加入tEARCl45细胞，培养基是加入低于未见细胞毒性 最大浓度的不同浓度样品的DMEM，细胞10％长满时，加入稀释10‘倍的PRRSV病 毒液感染60 min，吸去病毒液，加入含有不同浓度样品的DMEM培养基继续培 养96 h。8a、Fla和P26的各个浓度组中有的组各孔细胞的长满程度及细胞状态 与来感染病毒的阴性对照组没有明显区别。 由于8a未见毒性的最大浓度和上述抗病毒有效浓度的比率展大，且没有直 接杀灭病毒却可以抑制病毒在细胞中的增殖，作用机理独特，所以对初步判断具 有抑制病毒增殖活性的样品8a即黄芩的水提纯沉物进行进一步的验证和研究。 复旦大学硕士学位论文二．黄芩粗多糖抗PRRSV的研究 复旦大学硕士学位论文 二．黄芩粗多糖抗PRRSV的研究 (～)黄芩粗多糖的细胞毒性试验 6孔细胞培养板中均匀地加入MARCl45细胞，加入含不同浓度黄芩粗多糖的 DMEM培养基，培养96h后，将各孔细胞消化，制成均匀的细胞溶液，进行台盼 蓝(trypan blue)染色试验，倒置显微镜下，计数染色细胞和未染色细胞，计 算染色细胞即发生细胞病变(CPE)细胞的的百分比，结果发现，多糖浓度不高 于21．OOmg／mL时，发生CPE的百分比与未加多糖的阴性对照组无差别。 (二)黄芩粗多糖抗病毒引起的细胞病变作用 6孔细胞培养板中均匀地加入MARCl45细胞，加入含不同浓度黄芩粗多糖的 DblEM培养基，10％满时，按照初步筛选的方法感染病毒，同样加入含不同浓度 样品的DMEM培养基，继续培养96h，按照上述测定细胞毒性的方法进行台盼蓝 染色试验和MTT法测定细胞活性，根据台盼蓝染色试验结果计算样品50％／0制 细胞CPE发生的浓度IC∞=3．00±0．04 mg／ml(PO．05)。 (三)黄芩粗多糖抑制病毒形成空斑试验 在6孔细胞培养板中，均匀地加入MARCl45细胞，加入含不同浓度黄芩粗 多糖的DMEM培养基培养24h，按上述方法感染，进行病毒空斑试验，继续培养 96h，记录各孔细胞形成空斑的个数，与未加样品但染感病毒的对照组形成的空斑 数进行比较，计算50％抑制空斑形成的浓度Ic5。：3．1410．09 mg／ml(PO．05)。 (四)黄芩粗多糖抑制病毒抗原试验 在96孔板中均匀加入MARCl45细胞，加入含不同浓度黄芩粗多糖的DMEM培 养基，10％长满时，按上述方法感染，继续培养72h，纯乙醇固定30min，进行 免疫荧光分析，荧光显微镜下观察到感染病毒后，样品处理的各孔细胞随着样品 浓度的升高，有荧光的细胞所占的比率逐渐降低，直至没有特异性荧光。 (五)黄芩粗多糖抑制病毒增殖的试验 在6孔细胞培养板中，加入MARCl45细胞，加入不同浓度黄芩粗多糖的DMEM 培养基，感染病毒，继续培养72h，提取RNA，合成eDNA，迸行聚合酶连式反应 (PCR)，低浓度处理组及感染病毒未加黄芩粗多糖的阳性对照组有相应的条带出 现，高浓度处理组及未感染病毒的阴性对照组没有出现相应的条带。 三． 抗PRRSV活性跟踪下黄芩粗多糖的分离纯化和黄芩多糖SP2基本化学性质 的研究 (～)抗PRRSV活性跟踪下黄芩粗多糖的分离纯化 通过超滤，分成分子量小于10 000(I)和大于10 000(1I)两个组分， 抗病毒试验显示组分I的活性微弱，而组分II