马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产-生物工程专业毕业论文.docxVIP

马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产 马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产 万方数据 万方数据 马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖 酶的生产 摘 要 β-半乳糖苷酶又叫乳糖酶，可以催化乳糖水解，同时具有半乳糖苷转移作用， 在食品工业和乳清的生物降解等方面用途广泛。马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）具有酶活高、耐热性好、生产周期短、抗逆性强等优点。该酵母所 产的乳糖酶被认为是对人体安全无害的，因此马克斯克鲁维酵母十分适合乳糖酶 的工业化生产。 微生物中普遍存在葡萄糖阻遏作用，当有葡萄糖存在时，许多酶的合成和基 因表达都会受到抑制。K. marxianus 酵母乳糖酶的合成就会受到葡萄糖阻遏作用 的影响而导致发酵周期延长、酶产量降低和原料浪费等问题。在葡萄糖阻遏作用 中，由 MIG1 基因所编码的 Mig1 蛋白起着十分重要的作用。它在 Snf1 复合体的 作用下直接控制着相关基因的转录。本研究对 K. marxianus kmi 菌株的 MIG1 基 因进行了敲除，解除该菌株的葡萄糖阻遏，经筛选获得一株高产乳糖酶的葡萄糖 解阻遏突变株 kmi-17。经 PCR 和 2-脱氧-D-葡萄糖培养基验证，该菌株的葡萄糖 阻遏确实已经解除。筛选结果和荧光定量 PCR 结果均证明该菌株乳糖酶产量高 于野生型 kmi 菌株。对 kmi-17 菌株进行进一步的摇瓶发酵和 10-L 发酵罐发酵实 验，确定摇瓶发酵最佳发酵时间为 48 h，最高乳糖酶产量为 131.2 U/mL，比野 生型 kmi 菌株高出 62.5％；10-L 发酵罐发酵最佳时间为 24 h，最大乳糖酶产量 154.3 U/mL，比摇瓶发酵高出 17.6％。以上结果均表明 K. marxianus kmi-17 菌株 在乳糖酶的工业化生产方面具有很高的潜力。 转录激活蛋白是一类特殊的反式作用因子，它可以识别 DNA 序列上的特异 核苷酸顺序并与之结合,进而激活基因表达。有研究表明乳酸克鲁维酵母的 LAC9 基因作为正调因子调节乳糖酶基因的表达，因而推测马克斯克鲁维酵母的乳糖酶 转录激活蛋白基因 LAC9p1 同样具有促进乳糖酶基因表达的作用。本研究对 K. marxianus kmi 菌株的乳糖酶转录激活蛋白基因 LAC9p1 进行敲除并测定敲除菌 株的乳糖酶活力及基因转录水平，摇瓶发酵和荧光定量 PCR 实验结果均表明， LAC9p1 基因敲除菌株的乳糖酶基因转录水平和乳糖酶产量相比于原始 kmi 菌株 i 都有所下降。由此可见 LAC9p1 基因所编码的 Lac9p1 蛋白具有促进乳糖酶基因 表达的作用。构建了 LAC9p1 基因表达载体 pMD-rDNA-G418-LAC9，并对葡萄 糖解阻遏突变株 K. marxianus kmi-17 进行了转化，筛选出了一株乳糖酶产量更高 的 LAC9p1 基因超表达菌株 kml-1。荧光定量 PCR 证明该菌株的 LAC9p1 基因和 乳糖酶基因的转录水平均高于 kmi-17 菌株和野生型 kmi 菌株。对 kml-1 菌株进 行进一步的摇瓶发酵和 10-L 发酵罐发酵实验，确定摇瓶发酵最佳发酵时间为 48 h，最高乳糖酶产量为 150.5 U/mL，比 kmi-17 菌株摇瓶发酵结果高出了 14.4％。 10-L 发酵罐发酵最佳时间为 24 h，最大乳糖酶产量为 205.4 U/mL，比 kmi-17 菌 株 10-L 发酵罐发酵结果高出 33.1％。由此可见 kml-1 菌株在乳糖酶的工业化生 产方面具有更高的潜力。 关键词：马克斯克鲁维酵母；乳糖酶；葡萄糖阻遏；转录激活蛋白；发酵 Over-expression of ?-galctosidase gene in Kluyveromyces marxianus and high production of lactase by fermentation Abstract β-galactosidase (commonly also known as lactase) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of terminal non-reducing β-D-galactose residues in β-D-galactosides. Conventionally, its main application has been in the hydrolysis of lactose in milk or its products. Kluyveromyces marxianus is very suitable for industri