绿针假单胞菌GP72中氧化应激调控因子OxyR的研究-生物化工专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 绿针假单胞菌 GP72 中氧化应激调控因子 OxyR 的研究 摘 要 绿针假单胞菌 GP72 是本实验室从上海郊区甜椒根际土中分离筛选 到的一株具有生物防治功能的假单胞菌属菌株，可以产生 3 种吩嗪抗生 素，而吩嗪抑菌机理就是通过大量过氧化物或者超氧化物的产生来杀死 植物病原体。然而，产生这样一种具有氧化还原活性的物质，菌体本身 又怎样避免伤害，其机理还不清楚。而这种机理的研究，将有助于 GP72 吩嗪产量的提高与生物防治作用。生物信息学分析显示 OxyR 是 GP72 中一个具有氧化还原调控作用的调节子，有研究表明其对氧化应激和抗 生素产量都有影响。本课题通过基因改造首次研究了氧化应激调控因子 OxyR 在 GP72 中的作用。发现 oxyR 基因突变对 GP72 的生存能力，运 动性、吩嗪物质产量、不同氧化剂的抗性、生物膜的形成和所调控基因 的表达都产生了不同的影响。 首先从与 GP72 亲缘性相对较高的菌株的 oxyR 基因入手，通过保守 区比对设计引物，克隆得到 oxyR 基因；氨基酸序列比对分析发现，OxyR 中两个过氧化氢反应相关的半胱氨酸残基高度保守，表明 OxyR 与 GP72 氧化应激作用相关联。 其次，运用分子生物学方法构建 oxyR 基因突变、回补和过表达菌株， I 从生长、存活能力、运动性、菌落形态和吩嗪产量等方面考察了其功能。 结果表明，oxyR 基因突变使得 GP72 在 LB 平板上的生存能力和运动性 降低，液体培养时三种吩嗪物质产量均下降。而这种生存能力的下降可 以通过往培养基中添加过氧化氢酶得到恢复，表明 OxyR 对 GP72 的氧化 应激和吩嗪合成具有重要作用。 接着，根据吩嗪的抑菌机理和 OxyR 的氧化应激调控作用，选取两 种主要氧化剂百草枯和过氧化氢，对突变株在氧化应激环境下的氧化敏 感性、氧化剂抗性和生物膜形成等进行了研究。实验结果表明，oxyR 基 因突变使得 GP72 在 KB 平板上对百草枯和过氧化氢的抗性均有不同程度 的下降。然而，在 KB 液体培养基中，oxyR 基因突变株在经过生长初期 的延迟后，表现出在 1mM~5mM 浓度范围内对过氧化氢的高抗性。除此 之外，突变株在不同氧化剂中形成生物膜的能力也受到影响，尤其是突 变株在百草枯处理后其生物膜产量显著增加。进一步说明了 OxyR 在 GP72 氧化应激中起到的重要作用。 最后，通过 qRT-PCR 实验，发现在过氧化氢存在的条件下，oxyR 基 因突变使得 katG、ahpC、ahpD 和 phzE 表达量增加，尤其是 katG 表达 量增加约 18 倍，说明其可能在 GP72 中对过氧化氢的应激起主要作用。 同时也表明 oxyR 基因的缺失有益于过氧化氢诱导的基因表达。由此可 见，作为全局性调控因子，OxyR 通过调控多种途径来帮助 GP72 应对不 同的氧化压力。 II 关键词：绿针假单胞菌，OxyR，氧化应激，吩嗪，过氧化氢，生物膜 III INVESTIGATION OF OXIDATIVE STRESS REGULATOR OXYR IN PSEUDOMONAS CHORORAPHIS GP72 ABSTRACT 2Pseudomonas chlororaphis GP72 is an important plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) with wide-spectrum antibiotic activity towards several soil-borne pathogens, it produces three phenazine antibiotics. The mechanism of phenazines against phytopathogens is the accumulation of toxic reactive oxygen species (ROS) including superoxide (O -) and hydrogen peroxide (H2O2). However, little is known about how P. chlororaphis GP72 adapts to such oxidative stress environment produced by its own abundant phenazines. This mechanism will benefit P. chlororaphis GP72 to increase phenazines production and play the role in biocontrol. The bioinformat