毛豹皮樟基因组总DNA的提取及RAPD技术体系的建立-森林培育学专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 本试验以毛豹皮樟的叶片为材料，通过对不同的DNA提取方法进行试验，寻找 最佳的毛豹皮樟DNA提取方法；优化扩增程序和反应条件，建立起毛豹皮樟的 RAPD技术体系；并将该技术体系应用于80个毛豹皮樟叶片的RAPD扩增中。结 果表明： 一、使用改良SDS提取法有效地解决了毛豹皮樟基因组总DNA提取中的褐变 问题，同时所提取的DNA均呈白色絮状，A26dA280值都在1．8以上，从检测所得产 率和纯度可知该DNA模板完全可以用于RAPD分析；另外，该方法还具有成本低、 操作简单、省时等特点。 二、用CTAB法提取毛豹皮樟叶片的DNA时，所得DNA量很少，而且模板 中含色素、蛋白质等杂质很多，在后期进行RAPD扩增时，杂质的影响导致扩增不 稳定或者扩增失败，表明CTAB提取法对于含酚类等次生物质较多的物种并不适 用。采用常规的SDS法所得的DNA量很少，而且模板中含色素、蛋白质等杂质很 多，在后期进行RAPD扩增时，杂质的影响导致扩增不稳定或者扩增失败。 三、扩增程序采用：预变性温度为94。C lmin，变性温度为94。C lmin，复性温 度为34。Clmin，72*C延伸2min，共45个循环，最后72℃延伸10min，同时反应体 系(20I_tl反应体系)采用：dNTPsO．4ul(各含1Nm／I．d)，10×PCR21al，MgCl22lal， Taq酶0．31xl(0．5u／l_t1)，H2011．39l，DNA模板29l(40ng)，Primer 29l(0．8Pm／91)，能 够得到清晰稳定的扩增带谱。 四、将所建立的RAPD技术体系应用于20个毛豹皮樟叶片DNA的RAPD扩 增中，筛选出16个引物，所得的谱带清晰，多态性高达46．8％，反映了各试材之 间在DNA序列上存在相当大的差异，可用于毛豹皮樟的种质资源鉴定分析。 五、用筛选出的部分随机引物对80个毛豹皮樟的DNA模板进行RAPD扩增， 得到了稳定的RAPD带谱。这些特征引物对各种材料扩增所得到的特征谱带反映了 基因组总DNA碱基序列的特异性，可用于聚类分析。 关键词：毛豹皮樟DNA提取 RAPD技术 Isolating Isolating Genomic DNA from the Leaves ofLitsea coreana Ldvl．pat．ianuginosa and Establishment of RAPD Techniques Gong Yanhong (CollegeofForestry andHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity Ya’all，Sichuan，China，625014) Abstract Using the leaves of Litsea coreana LdvL vat．ianuginosa as materials，different ways of isolating genomic DNA were tested to find the best one．At the same time，the optimal Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)techniques for Litsea coreana LdvL tar． 1anuginosa(Migo)Yang et P．H．Huang were established and applied to 80 leaves．The results were as follows： 1)Using improved SDS method WaS an economic，easy and fast way to isolate genomic DNA．It could obtain qualified DNA from plants containing high polyphenols， The DNA was qualified for RAPD analysis． 2)Using CTAB method and SDS method could isolate only a little amount of DNA， farther more．the DNA contains secondary substances such as pigment and protein．As a result，the amplification Was instable or failed． 3)The PCR products were stable when the PCR Was 45 cycles ofpredenature at 95 ℃for 1 minute．den