慢病毒介导的RNAi沉默p21基因对鹿茸干细胞生物学特性的影响-特种经济动物饲养专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture Effects of Lentivirus-mediated RNAi p21 Gene Silence on Biological Characteristics of Antler Stem Cells Submitted by GuoQian-Qian Supervised by Prof. LiChun-Yi JiangsuUniversity of Science and Technology June, 2014 江苏科技大学理学硕士学位论文 江苏科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日 江苏科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： (1)保密□，在年解密后适用本授权书。 (2)不保密□。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 摘要 摘要 摘要 背景与目的：鹿茸是一种可完全再生的哺乳动物附属器官，被作为一种生物学模 型受到广大学者的关注，搞清鹿茸再生机制有望为人类肢体再生提供可借鉴的理论依 据。生茸区骨膜细胞（APCs）与角柄骨膜细胞(PPCs)分别是鹿茸发生与再生的关键， 均具有干细胞特性，因此也分别称为鹿茸发生干细胞(SCAG)与鹿茸再生干细胞(SCAR)。 有限的鹿茸干细胞可以在短短的两个月内生成完整的鹿茸组织，这在其他哺乳动物器 官组织中是不可能完成的。组织器官再生源于细胞的分裂增殖，细胞的分裂增殖依赖 于细胞周期调控，因此对鹿茸干细胞周期的研究对揭示鹿茸再生机制具有重要意义。 p21 是一种细胞周期的主要调控因子，与 p53 共同构成细胞周期的 G1 检查点。研究发 现 p21 单基因敲除使普通小鼠获得了同 MRL 小鼠一样闭合耳洞的能力，同时相关再 生细胞具有特殊的细胞周期分布（G2/M 阻滞），很多再生模型中也都发现了相同的 G2/M 积聚现象。但检测鹿茸干细胞周期，没有发现特殊的 G2/M 期阻滞（未发表）， 推测可能与 p21 基因有关，为证明这一假设，并探讨 p21 基因在鹿茸再生中的作用， 本实验通过 RNA 干扰技术来研究沉默 p21 基因对鹿茸干细胞生物学特性的影响。 方法：1、利用在线设计软件与通用 RNAi 设计法则筛选出针对东北梅花鹿 p21 基 因的 RNAi 高分靶位点，化学合成并体外退火，与载体质粒 PLVTHM 重组，通过 PCR 鉴定及测序鉴定筛选出阳性质粒。2、重组质粒与 pMD2.G、pCMV-dr8.9 质粒共转染 到 293t 细胞，收集并浓缩含有目的基因的慢病毒载体。慢病毒感染，流式细胞仪分选 阳性细胞，Q-PCR 检测转染后 PP 细胞中 mRNA 表达量。3、MTT 法检测细胞在传代 早期与后期的增殖速率；流式细胞法检测细胞周期与细胞凋亡；β-半乳糖苷酶染色检 测细胞衰老；彗星电泳实验检测细胞 DNA 损伤。 结果：1、成功筛选了 2 条针对东北梅花鹿 P21 基因的 RNAi 高分靶位点并化学合 成，体外退火获得双链寡核苷酸链；2、与载体质粒 PLVTHM 连接，成功获得重组质 粒；3、通过三质粒系统转染 293t 细胞，成功获得大量慢病毒粒子；4、通过感染 PP 细胞并分选，获得稳定感染的细胞株；5、RT-PCR 检测显示转染细胞 p21 基因 mRNA 表达量显著降低；6、对感染后细胞生物学特性检测发现：传代早期细胞增殖速率无显 著变化，传代后期细胞增殖速度明显高于对照组；细胞周期无显著变化；细胞凋亡数 显著增多；细胞衰老被抑制；细胞 DNA 损伤明显增加。 结论：本实验成功构建了针对东北梅花鹿 p21 基因的慢病毒表达载体，并获得了 p21 基因沉默的稳定 PP 细胞株，为 p21 基因在鹿茸细胞中的功能研究建立了基础模型； 对感染后细胞生物学特性的检测，确定了 p21 单基因的表达下调不会影响 PP 细胞的 细胞周期与细胞增殖速率，从而判断