慢病毒载体介导的IDO基因在人脐带间充质干细胞表达的实验研究-临床检验诊断学专业毕业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 慢病毒载体介导的 IDO 基因在人脐带间充质干细胞 表达的实验研究 中文摘要 目的：1，从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs），并对 hUC-MSCs 的生物学特性进行研究； 2，构建共同表达人 IDO 基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的慢病毒表达载体，并进行慢病毒颗粒的包装，纯化，浓缩 及滴度测定； 3，以 EGFP 作为报告基因，筛选慢病毒转染 hUC-MSCs 最佳 MOI 值；研究携带 重组 IDO 基因慢病毒颗粒转染 hUC-MSCs 后，基因及蛋白表达的情况，并对转染 后的 hUC-MSCs 的生物学特性进行探讨。为进一步利用基因修饰的间充质干细胞 对再障小鼠模型的治疗打下基础，为再生障碍性贫血的治疗寻找新的途径。 方法：1，采用组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，培养 2 周后得到贴壁细 胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态，细胞计数绘制细胞生长曲线；应用流式细 胞仪鉴定细胞表面标志；化学染色检测体外诱导成脂和成骨分化的能力； 2，设计相应引物，从含有人 IDO 基因的 cDNA 文库中，利用 PCR 方法钓取人 IDO 基因的全长编码区片段。将目的因与经酶切线性化的慢病毒表达载体 GV218-EGFP 进行定向的连接，将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落 PCR 鉴定 并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒 共转染 293T 细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况；实时荧 光定量 PCR 检测慢病毒浓缩液的滴度。 3，取足月儿脐带以组织块贴壁培养法分离培养 hUCMSCs，以不同的感染复数 （multiple of infection，MOI ，分别为 0、10、20、30、50、100）的重组慢病毒感 染 hUC-MSCs，通过报告基因 EGFP 的表达筛选最佳 MOI；用 IDO 重组慢病毒以 最佳 MOI 值感染 hUC-MSCs 作为实验组，以空载体转染的 hUC-MSCs（空载体组） 及未转染的 hUC-MSCs（空白组）作为对照，应用 RT-PCR 及 Western blot 法分别 检测细胞中 IDO mRNA 及 IDO 蛋白水平的表达情况。 结果：1，体外培养 8-10d 左右，细胞从组织块中爬出；细胞传代培养至第 10 代， 无明显形态及增增殖能力改变；细胞阳性表达 CD44，CD73，而 CD34 表达阴性。 体外诱导实验证实，hUC-MSCs 具有成脂及成骨分化的能力。 2，经 PCR 及基因测序鉴定 GV218-EGFP-IDO 重组慢病毒表达载体构建成功，包 装慢病毒 Lentivirus-IDO 滴度为 2×108TU/mL。 3，分别以不同 MOI 值的重组慢病毒感染 hUCMSCs 后，通过 EGFP 表达的阳性 细胞数筛选其最适 MOI 为 30，此时对细胞的转染效率可达到 80%以上。RT-PCR 检测显示实验组 IDO mRNA 表达阳性，空载体组和未转染组均为阴性；Western blot 检测示实验组细胞内 IDO 蛋白表达阳性，空载体组和未转染组均为阴性。 结论：1, 体外成功分离与培养了 hUC-MSCs，具有间充质干细胞生物学特性； 2, 成功构建并包装出高滴度的人 IDO 基因重组慢病毒载体； 3，筛选出最佳 MOI 值为 30，携带重组人 IDO 基因慢病毒颗粒感染 hUC-MSCs 后， 其在基因及蛋白水平均阳性表达 IDO。 关键词: IDO基因；绿色荧光蛋白；转染；慢病毒表达载体；脐带间充质干细胞 Experimental study on construction of lentiviral vector carrying the IDO gene and its expression in the hUC-MSCs Abstract Objective: 1,To isolate and culture umbilical cord mesenchymal stem cells from human umbilical cord in vitro, and explore its biological speciality. 2,To construct the lentiviral vector to co-express enhanced human Indoleamine 2，3-dioxygenase( IDO)