马立克氏病病毒类白细胞介素8基因表达及生物学特性研究-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

张鑫字MDV 张鑫字MDV vIL．8基因表达及生物学特性研究 中文摘要 马立克氏病病毒(MDv)是一种致T细胞瘤的疱疹病毒，然而病毒的致肿瘤 机制仍不十分清楚。本研究通过RT．PCR法，从感染MDV标准毒株648A、RBlB、 MDll、CVl988、z4、HvT感染的CEF细胞总RNA中扩增vlL一8基因序列。实验 结果表明，I型MDV毒株均可扩增出约430bp的eDNA片段，II、ⅡI型MDV未 能扩增出相应片段。将扩增出的基因片段克隆进载体pGEM—T easy中，构建成 pT-vlL8质粒，进行测序，通过序列分析证明，所获得的648A、RBlB、MDll、 CVl988毒株的vlL一8基因序列与所发表的GA株的vlL一8序列完全一致。这一结 果表明，vlL一8基因在I型马立克氏病病毒基因组中为一高度保守序列，提示该序 列可用于MDV I型病毒的鉴定。 为了进一步了解vlL一8的生物学活性，我们用限制性内切酶Baml-1I及EcoR I酶切消化pT．vlL8质粒，然后插入经BamH I及EcoR I酶切好的原核表达载体 pGEX一5X．3中，构建成pGEX-vlL．8质粒，将pGEX．vlL．8质粒DNA转化大肠杆 菌BL21，以IPTG诱导表达。研究结果证明，所构建的表达质粒能表达vlLg-GST 融合蛋白，说明融合表达性质粒pGEX—vIL8构建正确。表达产物活性分析发现， vlL一8基因重组产物具有趋化鸡外周血淋巴细胞的活性，这一结果提示MDV在感 染过程中，vlL一8吸引易感细胞，促进病毒感染，并可能参与了肿瘤的扩散和发展。 将vlL-8基因片段插入真核表达载体pcDNA3．1(+)‰，构建成真核表达性质粒 pcvlL一8，将其转染宿主细胞COS．1，取转染48小时后的细胞培养上清做趋化试验， 试验结果证明COS．1细胞表达了vlL一8多肽，细胞上清有明显的趋化活性，且滴 度高达105。 细胞因子往往具有免疫调节作用，尤其在基因免疫过程中，该作用更为明显。 为了弄清病毒编码的vlL8是否也具有免疫调节作用，本研究将转染pcvlL．8 DNA 的COS一1细胞培养上清与人0型血红细胞(RBC)混合，腹腔免疫注射小鼠，同时 设立对照，测定在含有vlL．8的情况下，小鼠对人0型RBC的抗体反应性。通过计 算抗体积数，t检验分析不同处理组的差异性。实验结果表明，小鼠抗O型RBC 的抗体滴度在实验组与对照组差异不显著，这一结果提示，vlL一8对肌体体液免疫 无明显的调节作用；为进一步证明这样的结论，我们用同样的设计，采用不同的 免疫原进行了试验。即将vIL．8真核表达载体(pcvlL一8)与J亚群白血病的onv 基因真核表达载体(pcALV．Jenv)联合基因免疫5日龄鸡，分别间隔lO天采血、 塑矍盔兰矍查兰垒笙苎 塑矍盔兰矍查兰垒笙苎 一——一2 分离盘滇，雳阕接受疫荧光法检测挠俸滚度。苏periL-8摆矮粒与黼活疫蓥联合 免疫雏鸡。试验结果表明，试验组与对照组抗体滴度无显著荔异，这些结果表明， 上述免疫途径簸方法船入辩vlL一8，对梳体俸液免疫无疆显静调节依雳，然而透过 其它途径能否对机体免疫有调节作用还裔特进一步的研究。 关键词：马立克氏病病毒；病毒类白细胞介素8；序歹0分祈；表达；趋化性；兔 疫源性；免疫调节 张鑫字MDV 张鑫字MDV vlL-8基嚣表达叠生物学特性耩究 3 Expression of viral interleukin 8 gene of Marek’s disease virus and its biological characterizations M．S．Candidate：Xinyu Zhang Supervisor：Prof．Aijian Qin Abstract：Marek’S disease virus(MDV)is a herpesvirus which induces the tumor of T cells in chickens，However its oncogenic mechanism is still unclear．In this study, total RNAs were respectively extracted from chicken embryo fibroblast(CEF)cells infected with MDV reference strain 648A、RBlB、MDIt、(jVl988、Z4 and HVt and the eDNA sequences of viral interteukin 8(vlL-8)were amplified by RT-PCIL The results showed that only