慢性髓系白血病STI571耐药中PTP活性检测和Bcr-Abl基因ATP结合区的测序分析-内科血液病学专业毕业论文.docxVIP

硕士学位论文’慢性髓系白血病ST 硕士学位论文 ’慢性髓系白血病ST I 571耐药中PTP活性检 ,贝JJ,fn Bcr-Ab I基因ATP结合区测序分析 硕士研究生：樊伟 指导教师：刘晓力教授 摘要 研究背景和目的： 慢性髓系白血病(CML)是一种累及造血干细胞的恶性 克隆增殖性疾病。Ph染色体是其肿瘤恶性克隆标志，所形成的BCR—ABL融合基]删p210BC眦8，具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase， PTK)活性，是导致慢性髓系白血病发生的根本原因。细胞内蛋白质磷酸化的平 衡状态有赖于蛋白激酶和蛋白磷酸酶的协同作用，酪氨酸残基(Tyr)的磷酸化 是一个可逆的动态过程，主要受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，盯P)两大酶家族控制，他们相互拮抗与协调，在机体内构 建了一个Tyr磷酸化状态的凋节网络。 ．通过抑$1]Bcr—Abl酪氨酸激酶活性，进而抑$[JCML细胞增殖并诱导CML细 胞凋亡是治疗CML新的策略。STl571又名甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)、 格列_1；!．(Gleevecl，是第一个被批准上市的酪氨酸激酶抑制剂，作用靶点为bcr／abl 蛋白酪氨酸激酶，它能竞争性抑％IJATP或底物与酪氨酸激酶催化中心结合，阻滞 酪氨酸激酶活化作用，阻断其下游信号转导，直接靶向费城染色体(Philadelphia chromosome，Ph)5B性细胞，从而阻止细胞的增殖和肿瘤的形成。本课题组前期 研究结果：STl571处理K562细胞后，盯P家族的部分成员表达上调，提示有相关 PTP参与了STl571诱导K562细胞凋亡的过程。随着临床应用病例数的增加， STl571的耐药问题引起了人们的关注。尤其是该药对CML急变期的病人治疗效 果不理想，耐药问题已成为是抗肿瘤治疗失败的主要原因。 中文摘要目前的研究表明，STl571的耐药机制有多种，包括非特异的多药耐药基因 中文摘要 目前的研究表明，STl571的耐药机制有多种，包括非特异的多药耐药基因 表达pcr．Abl基因本身的遗传变异和其它蛋白激酶的活化等等。原发耐药绝大多 数与Bcr-Abl融合基因无关，获得疗效后再次复发者，大多数与Bcr—Abl酪氨酸 激酶的再活化相关，目前认为主要原因之一是Bcr／Abl融合基因ATP结合区的点 突变。 本实验拟通过耐药细胞系K562／G01的基因表达谱芯片检测、胞浆蛋[刍PTP 活性分析，初步确立了参与STl571的耐药过程的部分PTP成员；同时，对临床应 用STl571治疗的CML病人进行P1’P活性检测和Abl基因ATP结合区序列分析，以 确立二者在STl571耐药诊断中的临床意义。 研究方法： 1．I562／G01细胞系在本实验室条件下的耐药特性的鉴定：用MTT法检测 STl71对细胞的细胞毒作用、Hoechst 33342荧光染色检测调亡情况。 2．利用cDNA表达谱芯片技术初步筛选耐药细胞K562／G01与K562／W差异 表达基因，应用半定量RT-PCR技术验证芯片结果；进一步检测耐药细胞 K562／G01、对STl571耐药的CML病人单个核细胞胞浆蛋白P仲活性，了解PTP 与耐药的相关性。 3．将CML病人分为对STl571耐药和非耐药两组，进行骨髓单个核细胞Abl 基因ATP结合区序列分析，了解Abl酪氨酸激酶ATP结合区点突变情况。PCR产 物的序列长度为344bp，其中的180bp(98bp～277bp)为Abl激酶的第906bp 1085bpDNA序列片段，涵盖了Abl激酶的ATP结合区序列。 研究结果： 1．MTF法检测细胞STl571耐药性：K562．W和K562／G01的IC50(半数抑 制浓度)分别为(O．48±2．04)uM和(5．67±1．52)uM，K562／G01的耐药倍数 为(11．8±1．35)倍。Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡百分率：STl571浓度 4．0uM培养24h后活细胞百分数仍达98．5％，说明K562／G01对抗STl571的调 亡作用明显增强。。 II 硕士学位论文2．耐药细胞K562／G01基因表达谱芯片分析发现：总共有566个基因出现差异 硕士学位论文 2．耐药细胞K562／G01基因表达谱芯片分析发现：总共有566个基因出现差异 表达，297个基因表达下调，269个基因表达上调，其中1个P口成员出现表达下 调[PTPRF(PPFIA4)基因，Ratio 0．413，Genbank ID：NM_015053】，1个PTK成员 表达升高(PTK9基因Ratio=2．004，Genebank ID：NM 198974)。