阿维菌素的发酵.doc

阿维菌素的发酵 阿维菌素的发酵 一、实验目的 学习阿维菌素的发酵过程 　　二、实验原理 阿维菌素的发酵共分三大工序：菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。 衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。 　三、实验材料 　　1. 菌株 阿维菌素链霉菌斜面菌种。 　　2. 培养基 培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录Ⅲ。 　　3. 仪器及药品 接种环，培养皿，三角瓶，摇床，离心管，高效液相色谱柱，漩涡振荡器，微孔滤膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，无菌水。 　四、实验方法 　　1. 实验用菌种的制备 　　（1）单孢子悬液的制备 向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水，用接种环刮取孢子，震荡打碎，过滤得到单孢子悬液。 　　（2）自然分离 将得到的单孢子悬液稀释，分别涂布于含有分离培养基的平皿中，在28℃条件下培养7～9天。 　2. 发酵培养基和待检测发酵液样品的制备 　　（1）水解淀粉的制备 称取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均匀，加热使其糊化，降温至60℃，然后在糊化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶，恒温搅拌10min，最后加热至沸腾状态，保温5min，使残留的淀粉酶失活，降温待用。 　　（2）液体发酵 铲取面积为0.5×0.5㎝2大小的斜面培养物，将其接种至种子瓶的培养基中，28℃摇床培养22h后，按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中，28℃培养9天。 （3）检测发酵液中阿维菌素样品的制备 取5mL摇瓶发酵液于离心管中，3000r/m离心10min，弃去上清夜。在发酵液的沉淀物（菌丝体）中加入2mL丙酮，在漩涡式混合器上震荡1min，静置10min，如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯，震荡1min，静置10min，3000r/m离心10min，最后小心地吸取其中的上清夜作为样品，待检测。 　3. 阿维菌素含量的测定 利用高效液相色谱法（HPLC）检测 　　（1）HPLC条件 色谱柱 ：Kromasil C18 5μm 200×4.6mm 流动相： CH2OH∶H2O﹦88∶12(V/V) 流速：1.0mL/min 检测波长：244nm 　　（2）标准曲线的测定 配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液（500～3000μg/mL），分别取各浓度标准溶液的过滤液5μL注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰值面积，然后对浓度（Y）和吸收峰面积（X）进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。 　（3）效价的计算方法 将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用0.45μm的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液5μl注入HPLC中，记录色普图，将B1峰面积代入上述的回归方程中，计算得到发酵液中B1组分发酵单位（μg/mL）。 　　4. 发酵液中菌体浓度的计算 取体积为V1（mL）的发酵液，3000r/m离心10min后，得到上清夜的体积计量为，V2（mL），那么发酵液的菌体浓度为： 菌体浓度＝[（V1－V2）/ V1]×100% 　　五、实验报告 绘制标准曲线，并记录实验结果。