绿色木霉中纤维素酶相关基因的克隆、定点突变及其真核表达-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

I I 摘 要 纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源，有效利用纤维素资源，可以缓解世界范 围内日益突出的粮食和能源短缺问题。纤维素酶通过纤维素酶中三种组分：内切葡聚糖 苷酶（endoglucanase，EG），外切葡聚糖苷酶（cellubiohydralases，CBH），以及β-葡萄 糖苷酶（β-glucosidases，BG）的协同作用将纤维素水解为葡萄糖。纤维素酶的酶活力影 响着纤维素酶在工业生产中的应用，运用基因克隆、基因表达、纤维素酶蛋白分子的改 造和设计等手段获得人们所期望的高酶活的纤维素酶成为研究热点。绿色木霉 （Trichoderma viride）是产纤维素酶活性最高的菌株之一，它在自然界分布广泛，常腐 生于木材、种子及植物残体上。白蚁（Coptotermes formoscmus）以朽木等富含纤维素的 木质性物质为食，肠道微生物中富含纤维素降解菌。 本论文从室外多年放置的朽木中分离得到可分解纤维素的真菌G-1，从白蚁肠道微 生物中分离得到可分解纤维素的真菌G-2，经过菌落形态和菌丝形态观察及18Sr DNA序 列分析鉴定真菌G-1，G-2为绿色木霉（Trichoderma viride）。从G-1中克隆得到内切葡聚 糖苷酶基因（ EG Ⅱ , Genbank:HM116999.1 ）和外切葡聚糖苷酶基因（ CBH Ⅱ , Genbank:HM117000.1），从G-2中克隆得到两个β-1，4-葡萄糖苷酶基因（BGⅠ, Genbank: HM178944.1；BGⅡ, Genbank: HM178945.1）。根据序列比对分析，对克隆到的EGⅡ和 CBHⅡ基因序列进行定点突变，得到两条突变序列EGⅡ-mut和CBHⅡ-mut，使其编码的 氨基酸序列产生突变，意在增加其表达蛋白的酶活力。 将EGⅡ, EGⅡ-mut, CBHⅡ去掉自身信号肽序列，构建分泌型表达载体pPIC9K-EG Ⅱ，pPIC9K-EGⅡ-mut，pPIC9K-CBHⅡ，转入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 进行诱导表达。经MD, MM板筛选得到转化子，用刚果红染色法进进行粗筛，再用DNS 法对酶活性进行测定，筛选得到胞外分泌酶活力较高的重组毕赤酵母菌株GS115-EGⅡ -7，GS115-EGⅡ-mut-10，GS115-CBHⅡ-2。GS115-EGⅡ-7，GS115-EGⅡ-mut-10的内切 葡聚糖酶活力分别为20.915U/ml，24.110U/ml。GS115-CBHⅡ-2的外切葡聚糖酶活力达 到27.925U/ml。突变序列（EGⅡ-mut）的重组毕赤酵母菌株比原序列（EGⅡ）的重组 毕赤酵母胞外分泌内切葡聚糖酶的酶活力提高了，结果表明某些定点突变可以揭示影响 酶活的重要功能域，为使用分子生物学的方法改造纤维素酶基因以获得高酶活的纤维素 酶奠定基础。 本论文构建了6个酿酒酵母表达载体，pYES2/CT/lacZ-EGⅡ, pYES2/CT/lacZ-EGⅡ -mut, pYES2/CT/lacZ-BGⅠ, pYES2/CT/lacZ–BGⅡ, pYES2/CT-CBHⅡ, pYES2/CT-CBHⅡ -mut，为后续的工作奠定了基础，即转化酿酒酵母后获得重组菌株，取重组的内切葡聚 糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力最高的酿酒酵母，分别发酵至活性 最高的时间后按照不同比例混合菌液，筛选降解秸秆纤维素速率最快的比例，实现高效 率的纤维素水解和发酵同步进行。 关键词：绿色木霉；纤维素酶；定点突变；毕赤酵母；酶活力 II II Abstract： Cellulose is one of the most abundant renewable resources in the earth; efficient use of fiber resources may alleviate the increasingly serious shortage of food and energy all over the world. Cellulose is hydrolyzed into glucose by the cellulase synergy including three components: endoglucanase (EG), cellubiohydralases (CBH) and β-glucosidases (BG) .Cellulase activity affects its industrial application, so the cloning, expression of cellulase gene, and the modificatio