慢病毒过表达可溶性ST2蛋白对小鼠肺纤维化的抑制作用-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 宁波大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了 谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 签名： 日期： 关于论文使用授权的声明 本人完全了解宁波大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论 文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 （保密的论文在解密后应遵循此规定） 签名： 导师签名： 日期： 宁波大学硕士学位论文 慢病毒过表达可溶性 ST2 蛋白对小鼠肺纤维化的抑制作用 摘 要 目的 白细胞介素(interleukin, IL)-33 是 IL-1 家族的新成员，而可溶性 ST2(soluble ST2, sST2) 是 IL-33 的一个诱饵受体，IL-33 主要通过 IL-33/ST2 信号通路在疾病中发挥生物学功能。 肺纤维化疾病是由多种病因导致的肺部纤维化的统称，它包括特发性肺纤维化、过敏性肺 炎、间质性肺炎、结节病、尘肺、药物或放射线等引起的肺纤维化。它是因为成纤维细胞 大量聚集、胞外间质沉积并且伴有炎症反应和损伤，导致的肺组织结构破坏。对于该疾病 目前国内外仍然没有有效的治疗药物。研究发现，在特发性肺纤维化病人和博莱霉素诱导 的肺纤维化小鼠模型体内 sST2 和 IL-33 的表达均升高。因此，本研究拟构建慢病毒表达载 体过表达可溶性 ST2 蛋白，研究 ST2 在小鼠肺纤维化中的作用及机制。 方法 1. 设计引物从 pcDNA3.1-mST2 质粒中扩增出全长的小鼠 ST2 基因，然后将 ST2 目的 基因与 pLVX-IRES-ZsGreen1 载 体 用 Xho I 和 BamH I 限 制 性 内 切 酶 切 割 ， 再 将 pLVX-IRES-ZsGreen1 载体大片段和 ST2 基因回收后，用 T4 连接酶连接并转化到大肠杆菌 感受态细胞中，构建 pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1 慢病毒表达载体。 2. 将构建的 pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1 重组质粒与慢病毒包装所需的三个辅助质粒共 转染到人肾胚(human embryonic kidney, HEK)293T 细胞中，进行 ST2 慢病毒包装，并测定病 毒的滴度及活性。 3. 建立博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型，将包装的 ST2 慢病毒上清浓缩后用鼻滴的方 法注射到模型小鼠体内，在注射博莱霉素后第 7 天和第 28 天分别处死部分小鼠，收集样本， 研究 ST2 对小鼠肺纤维化的影响。通过 HE 染色检测小鼠肺部炎症的变化；用天狼猩红染 色和羟脯氨酸含量检测小鼠肺组织纤维化和胶原纤维含量的变化；通过 RT-PCR 和 ELISA 方法检测相关细胞因子及趋化因子含量的变化。 结果 1. 通过 PCR 成功扩增出了小鼠 ST2 全长序列，将其插入到 pLVX-IRES-ZsGreen1 多克 隆位点中，成功构建了 pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1 慢病毒表达载体。 2. 将重组质粒 pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1 和辅助质粒共转染到 HEK293T 细胞中，成功 包装出了 ST2 慢病毒，将其浓缩后滴度可达 1011TU/mL，并且该病毒可以在真核细胞中表 达 ST2。 1 慢病毒过表达可溶性 ST2 蛋白对小鼠肺纤维化的抑制作用 3. 将 ST2 慢病毒注射到小鼠体内后，可以在小鼠肺组织中过表达可溶性 ST2 蛋白。小 鼠的肺部炎症明显得到缓解，其纤维化程度也较模型组减轻。第 7 天时 ST2 使小鼠肺组织 中 TNF-α mRNA 和蛋白、MMP9 mRNA 的表达增加，使 IL-4，IL-6 和 IL-13 mRNA 的表达 量降低。第 28 天时 ST2 使 MCP-1 和 MMP12 mRNA 的表达降低。另外，注射 ST2 慢病毒 后，小鼠 IFN-γ mRNA 的表达水平在第 7 天和第 28 天时均升高。 结论 成功构建了 ST2 慢病毒表达载体，将其包装成慢病毒，该病毒能够在真核细胞中表达 ST2 目的基因。将包装的 ST2 病毒注射到肺纤维化模型小鼠体内可使可溶性 ST2 蛋白过表 达，对小鼠肺纤维化具有抑制作用，但是其具体机制有待进一步研究。 关键词：白细胞介素 33， ST2， 慢病毒， 肺纤维化 2 宁波大学硕士学位论文 Lentivirus overex