棉花Bt抗虫基因与bar抗除草剂基因的双价植物表达载体的构建及转化的研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

I I 棉花 Bt 抗虫基因与 bar 抗除草剂基因的双价植物表达载体的构建 及转化的研究 摘要 棉花是重要的经济作物，但是由于棉花的生长长期受到虫害和杂草的侵害，就这两 项所造成的直接经济损失就占作物总产值的 10%~20%左右，因此棉花基因工程的发展 就大大促进了抗虫、抗除草剂以及抗逆等棉花品种的培育。 本研究利用 PCR 扩增出来的抗除草剂 bar 基因和实验室保存的抗虫 Bt 基因，成功 构建抗除草剂与抗虫双价植物表达载体 pBI121-bar/Bt。将植物表达载体 pBI121-bar/Bt 和 pBI121-Bt 分别转化至农杆菌工程菌菌株 LBA4404 中，并用转化后的农杆菌菌液，分 别侵染棉花新海 14、新海 16、新海 24 和新海 30 的胚性愈伤组织。对 pBI121-bar/Bt 转 化后的抗性愈伤组织进行了 PPT 浓度筛选，其浓度在 3.0 mg/L 时，胚性愈伤的生长良 好，同时筛选效果也明显；四种不同基因型胚性愈伤的生长情况中新海 24 的生长状态 最差，说明不同基因型对 PPT 的敏感性有差异。对转化后的头孢霉素浓度也进行了筛选， 结果表明：转化 pBI121-bar/Bt 基因的胚性愈伤在头孢霉素浓度为 800 mg/L 时，既能很 好地防止了农杆菌造成的污染，又能不抑制胚性愈伤的生长；转化 pBI121-Bt 基因的胚 性愈伤的有效头孢霉素浓度为 600 mg/L。说明转化不同基因后，胚性愈伤对抗生素的敏 感度有所不同。 转化 pBI121-bar/Bt 基因的不同棉花品种的胚性愈伤在 PPT 浓度为 3 mg/L，头孢霉 素浓度在 800 mg/L 时，新海 14 的胚性愈伤较其他品种出愈率最高，侵染后变黑程度较 轻；新海 24 的出愈率最低，侵染后变黑程度相对较严重。转化 Bt-4AB 基因的不同棉花 品种的胚性愈伤在 Kna 浓度为 50 mg/L，头孢霉素浓度在 600 mg/L 时，新海 16 的胚性 愈伤较其他品种出愈率最高，在农杆菌侵染后变黑程度较为最轻；新海 24 的生长情况 最差，变黑程度相对最严重；但胚性愈伤出愈率最低的是新海 30。 关键词：双价植物表达载体；抗虫；抗除草剂；遗传转化；PPT；头孢霉素；不同基 因型 II II Construction of plant expression vector containing insect resistant Bt gene and herbicide resistant bar genes and research on transformation of cotton Abstract Cotton is an important cash crop, but which was gotten the damage of pests and weeds in growth by the long-term. Directly. It caused the economic loss by the 10%~20% of crop output. So the development of cotton genetic engineering will greatly promote the cultivation of cotton in pests resistance, herbicide resistance and resistance. The research firstly amplificated the bar gene of herbicide resistance and the Bt gene of pests resistance by PCR, and then the bivalent plant expression vector pBI121-bar/Bt was constructed successfully. The Plant expression vector pBI121-bar/Bt and the pBI121-Bt were transformed into the LBA4404. Then the bacteria liquid infected the embryogenic callus in xh14 、 xh16 、 xh24 and xh30. Screening the PPT concentration though the resistance embryogenic callus, it suggested that the growth of embryogenic callus was good and the e