枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)活性物质的分离和功能测定-森林保护专业毕业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 中 文 摘 要 林果病害是一类重要的生物灾害，生物防治作为是林果病害管理中的一种有效持 续控制方法，是现代林业重大生物灾害可持续控制系统中的重要组成部分。枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis）是一种重要的生防内生菌。本研究从石榴果实中分离获得一株 内生菌-枯草芽孢杆菌 sdau08-96 菌株，研究结果表明该菌对多种林果病原菌有明显的 抑制作用。本研究通过对最佳发酵条件，抗菌物质的理化性质、分离纯化及功能测定， 初步探讨了枯草芽孢杆菌 sdau08-96 菌株生防机理，为该菌的开发利用提供依据，主 要结果如下： 1．产生抗菌物质的最佳培养基为 LB 培养基，装液量为 100/250mL，初始 pH 值 为 7.0、温度 28℃、接种量 10%、培养时间 72h 和转速 200r/m 时菌体生长良好，产生 的抗菌物质较多，抑菌活性高。 2．抗菌谱测定表明，sdau08-96 菌株产生的抗菌蛋白和挥发性物质对多种病原菌 都有较强的抑制作用，菌丝形态的变化相差不多，主要表现为，菌丝分支增多，扭曲， 部分菌丝细胞出现断裂和原生质浓缩现象，菌丝顶端和中部细胞膨大成球形或椭圆形， 部分菌丝变粗或纤细。抗菌蛋白较耐高温、耐盐、耐有机溶剂、耐酸碱性较好，挥发 性物质还可抑制病原菌菌丝色素产生的速度。 3．抗菌蛋白的分离采用的方法为 SDS电泳找出胞外目的蛋白条带，切下 条带测序，比对结果显示，胞外蛋白 A 条带与枯草芽孢杆菌膜关联的蛋白激酶的覆盖 率为 19%，胞外蛋白 B 条带与枯草芽孢杆菌脂蛋白的覆盖率为 25%，可以断定 A、B 条带为目的蛋白条带。 4．挥发性物质的分离纯化采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术 (HS-SPME-GC-MS）进行，经过 GC-MS 分析，挥发性活性物质共有 21 种不同组分， 这些物质分属于烷烃、醇、酸、酯、酚和醛等几类物质。 5．挥发性活性物质组分的功能测定结果表明，十五烷、二苯并呋喃、邻苯二甲酸 二乙酯、十四酸、2-丙烯酸十四烷酯和三聚乙醛 6 种物质的抑菌作用比较高，其中， 二苯并呋喃和三聚乙醛的抑菌率可以高达 80%；十四烷、4-羟基丁基丙烯酸酯、月桂 醇、月桂酸、十六烷酸和硬脂酸 6 种物质的抑菌作用在 20%以下或基本没有抑菌作用。 关键词：枯草芽孢杆菌 sdau08-96；发酵条件；活性物质；分离；功能测定 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活性物质的分离与功能鉴定 Abstract Tree and Fruit disease is a kind of important biological disasters, biological control is an important disease management method and component of sustainable control major biological disasters in modern forestry system. Bacillus subtilis is an important biocontrol bacterium. Bacillus subtilis strain of sdau08-96 is isolated from pomegranate fruit, the results indicated that it has obvious bacteriostatic action to a variety of tree and fruit disease pathogens. In this study, the best fermentation condition was determined through optimizing test,the purification and characteristics of the antifungal substances produced by Bacillus subtilis strain of sdau08-96 were studied in this article. The separation, purification and function identification of antimicrobial components were studied. The biological action mechanisms of sdau08-96 were also investigated. The results were as follows: The optimum fer