黄芪对关节软骨细胞生理功能影响的实验研究以及对治疗膝OA的临床观察-医骨伤科学专业毕业论文.docxVIP

成都中医药大学硕士学位论文 成都中医药大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 目的： 中 文 摘 要 1.探索一种消化、培养软骨细胞的简便有效的方法，为下一步实验提供 足够多的原代细胞； 2.研究黄芪甲苷对软骨细胞增殖的促进作用，为软骨组织工程短期内大 量种子细胞的获得提供一条新途径； 3.研究黄芪甲苷对软骨细胞合成细胞内蛋白质和 ECM 能力的促进作用， 了解黄芪对软骨细胞生理功能发挥的影响； 4.临床观察复方黄芪口服液对膝关节 OA 疼痛缓解和功能改善的作用。 方法： 1.分别采用非过夜消化法及过夜消化法分离软骨细胞，以 106 个/25cm2 培养瓶的密度培养细胞，比较两种方法的消化效果及其细胞的贴壁及生 长情况差异； 2.以黄芪甲苷作为生长刺激因子，设空白对照组，实验组分别为培养液 中黄芪甲苷浓度为 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、 160μg/ml： (1)一代细胞以 104 个/ 孔的密度接种于 24 孔板中，每组 3 孔，分别在 各组培养后的第 1 到 8 天的相同时间点消化收集细胞，计数法计数细胞， 绘制各组细胞生长曲线图，比较各组细胞增殖情况差异； (2)一代细胞以 104 个/ 孔的密度接种于 96 孔板中，每组 3 孔，分别在 各组培养后的第 1 到 8 天的相同时间点，MTT 法检测各组软骨细胞活性 差异； (3)一代细胞以 104 个/ 孔的密度接种于 24 孔板中，每组 3 孔，在培养 的第 5 天，各组分别收集 104 个细胞裂解，考马斯亮蓝染色检测各组一 定量细胞内蛋白含量的差异； (4)一代细胞以 104 个/ 孔的密度接种于置有血盖片的 6 孔培养板中，每 组 6 孔，培养 5 天后，其中 3 孔爬片用于甲苯胺蓝染色，另 3 孔爬片用 于番红 O 染色，检测各组软骨细胞合成 PG 的能力差异。 3.临床观察膝关节 OA 患者，治疗组服用复方黄芪口服液(10ml 口服 1 日 3 次），并加局部热敷(1 日 3 次)，对照组不用药物，嘱回家局部热 敷(1 日 3 次)， 8 周后随访。参照 HSS 评分中的疼痛评分和功能评分两 个主要项目评分，观察治疗组和对照组用药前后膝关节疼痛差异和功能 差异。 结果： 1.在两次细胞收集后，非过夜消化法软骨组织块消化溶解约 3/4，而过 夜消化后软骨组织块已基本完全消化溶解。非过夜消化分离出的原代软 骨细胞 12 小时开始贴壁， 36 小时完全贴壁，9 天长满瓶底壁；过夜消 化分离出的原代软骨细胞 8 小时开始贴壁， 24 小时完全贴壁， 7 天长 满瓶底壁。 2.(1)在黄芪甲苷浓度为 5－40μg/ml 范围内，软骨细胞增殖速度随着药 物浓度增大而加快，黄芪甲苷浓度达到或超过 80μg/ml 时，药物对软骨 细胞生长起抑制作用。培养 7 天，无药组细胞增殖至接种的 6 倍左右， 40μg/ml 组增殖近 10 倍，而 160μg/ml 组仅增殖 5 倍。 (2)从第 2 天开始，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml 组细胞活性 增强，随着药物浓度的增加细胞活性增强越明显；而 80μg/ml 和 160μg/ml 组细胞活性减弱，随着药物浓度的增加细胞活性减弱越明显。 (3)与无药组比较，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml 组软骨细胞 内蛋白含量明显增多，药物浓度越大，细胞内蛋白含量越高，40μg/ml 组最高，而 80μg/ml、160μg/ml 组软骨细胞蛋白含量明显减少，药物浓 度越大，细胞内蛋白含量越低。 (4)与无药组相比，从 5μg/ml 到 40μg/ml 组随着药物浓度增大细胞异染 反应逐渐增强，80μg/ml 和 160μg/ml 组异染反应减弱。 3.单纯热敷治疗 OA，治疗前后疼痛和功能分值差异均无统计学意义， P0.05；复方黄芪口服液加局部热敷治疗前后疼痛和功能分值差异均有 显著统计学意义，P0.01。 结论： 1.过夜消化法是一种可靠、实用、简便的软骨细胞消化分离方法。 2.黄芪甲苷具有促进软骨细胞增殖、合成细胞内蛋白以及 ECM 等作用， 这种作用在 40μg/ml