慢性间歇低氧大鼠模型内皮细胞与中性多核白细胞相互作用致内皮细胞损伤中炎症机制的研究-临床医学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于  不保密√ 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文摘要 天津医科大学硕士学位论文 摘要 研究背景与目的 中文摘要 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是 一种常见疾病，主要表现为睡眠状态下反复出现呼吸暂停和低通气，其重要病 理生理学改变是反复呼吸暂停形成的慢性间歇性低氧 （Chronic intermittent hypoxia ，CIH）。CIH 引发机体一系列氧化应激与炎症反应致血管内皮损伤， 显著增加冠状动脉动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的风险。氧化应激与炎 性反应的生物活性物质主要来源于激活的多形核粒细胞 （polymorphonuclear PMN），PMN 易被各种刺激因素包括 CIH 所激活, 且 PMN 占循环白细胞总数 的近 60%，与血管内皮细胞接触多、接触直接。PMN 与内皮细胞的相互作用是 多种疾病的病理生理学基础。为此，本实验通过分离常氧大鼠和 CIH 暴露大鼠 的 PMN 分别与常氧及 CIH 暴露的大鼠主动脉内皮细胞共培养，采用直接共培养 及 transwell 共培养方式，通过观察 TNF-α 及 NF-κB，探讨 CIH 环境下 PMN 与 内皮细胞的相互作用及机制。为临床上预防和治疗 OSAS 及其合并症提供理论 依据。 内容 1.不同间歇低 氧暴露条 件下内皮 细胞与 中 性多核白 细胞共培 养上清中 TNF-α 水平比较 2.不同间歇低氧暴露条件下内皮细胞与中性多核白细胞共培养后内皮细胞 中 NF-κB 水平比较 方法 8 周龄雄性 Wistar 大鼠 18 只，随机分为常氧对照组和间歇低氧组。CIH 组 暴露于间歇低氧环境中，氧浓度波动于 5.4%-20.7%，低氧频率为 30 次/h，8 h/d， 以模拟 OSAS 患者间歇低氧的过程。常氧对照组舱内充入相应频率及流量变化 的 压 缩 空 气 ， 持 续 时 间 6 周 [1] 。 6 周 后 处 死 大 鼠 ， 腹 主 动 脉 取 血 ， 双层 Ficoll-Histopaque 密度梯度离心法分离纯化 PMN。纯化的 PMN 在 RPMI -1640 培养基中重悬，调整细胞浓度为 1 x 106/ml[2]，用于与大鼠主动脉内皮细胞共培 养。 大鼠主动脉内皮细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI- 1640 培养液培养。内皮细 胞间歇低氧组暴露于间歇低氧环境中，300 秒为一循环，每个循环的前 45 秒向 I 细胞低氧舱内输入含 5%CO2、1.5%O2、93.5%N2 的混合气体，接下来 255 秒输 入含 5%CO2、21%O2、74%N2 的混合气体以模拟体内内皮细胞间歇低氧的过程， 周而复始形成 48 次循环，共 4 小时，每小时事件数为 12 次[3]。 共培养方式分为直接共培养和 tanswell 共培养。直接共培养为 PMN 细胞悬 液按比例直接加于接种有鼠主动脉内皮细胞的细胞培养孔中；transwell 共培养为 在细胞培养孔中置入 transwell 小室，于小室中加入相同体积的 PMN 细胞悬液。 共培养的 PMN 与内皮细胞的比率约为 10:1[2]。细胞加样结束后将细胞培养板置 于标准细胞培养箱中，共培养 4 小时。共培养结束后提取培养上清，ELISA 法 测定上清中的 TNF-α，Western blotting 测定内皮细胞中 NF-κBp65 浓度。 共培养分组如下： 1.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组（transwell 共培养） 2.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组（直接共培养） 3.CIH 内皮细胞+等体积细胞培养液组（transwell 共培养） 4.CIH 内皮细胞+等体积细胞培养液组（直接共培养） 5.常氧内皮细胞+常氧 PMN 组（transwell 共