斑马鱼Jak2a基因的克隆、表达及其对造血功能影响的初步研究.doc

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第一部分 斑马鱼疾病模型及基本实验技术 斑马鱼运用在造血研究领域已有 50 余载, 对斑马鱼胚胎的研究最早要追溯 至19 世纪30 年代, 前期关于斑马鱼的研究多限于动物实验学及药物毒理学方面 [1]。1970 年首次对斑马鱼的血细胞形态进行了详细的阐述[2, 3]。由于近代遗传 学实验方法的运用, 斑马鱼造血系统的研究进入了“近现代” 阶段, 近十年来主 要针对斑马鱼造血系统缺陷突变体的研究, 特别是对斑马鱼贫血疾病的认识[4- 6]。 造血系统遗传学实验学方法的应用最先起源于小鼠。起初, 实验研究模型主 要来源于自发突变体的小鼠[7] 。 而对于特定基因的功能学研究, 仍需依靠体内 转基因和基因打靶技术, 近 25 年，这些方法占据了小鼠实验的主导地位。然 而，反向遗传学功能性分析研究的基因具有定向性偏倚, 并且反向遗传学的基 因-基因研究方法并不能阐述所有的造血系功能基因。因此, 传统的人类血液学 疾病的遗传学基础仍不明确。 果蝇的造血系统与脊椎动物如哺乳动物是不同的[8]。在基因水平, 果蝇造血 系转录因子家族和信号通路是具有代表性的[8], 然而在细胞水平, 相对哺乳动 物, 果蝇的造血系发育较原始, 且固有免疫缺失。 运用正向遗传学筛选法寻找造血系突变体已有报道, 包括预期的(Ikaros13, c- Myb14, Gata-115)突变和预期外的突变 (C1galt116, Bcl-x(L)17)。 大量研究证实小鼠 遗传学筛选法具备可行性, 然而其高成本以及对设备的高要求性, 限制了其运 用的广泛性，常用于少数大规模性研究。因此，理论上，遗传学筛查法的应用十 分困难。而斑马鱼作为廉价，易饲养的脊椎动物模型, 特别适用于研究胚胎早期 发育(如体外发育快, 繁殖力强, 视觉透明性)。反向遗传学技术多运用于斑马鱼 目标基因的功能性研究[9, 10]，包括基因暂时性过表达和基因敲除, 稳定转基因 系可通过TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)或者从插入突变编 目目录中恢复稳定的突变等位基因获得[11, 12]。 正向遗传学筛选法获得的斑马 鱼突变体为造血系疾病研究提供了良好的动物模型。最新的正向遗传学筛选法已 经大规模展开[13, 14], 包括获得造血系突变体在内的研究正在进行[5, 6], 已报 4 万方数据 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 道的 8 个实验组正在筛选斑马鱼造血系突变体[15-22], 提示正向遗传学筛选方案 具有很强的可实施性。 斑马鱼的正常造血 胚胎造血研究 与哺乳动物卵黄囊造血类似，斑马鱼原始造血/胚胎造血位于解剖位置相互独 立的两个中胚层。红系发生细胞最早起源于原肠腔前期胚胎的腹侧位[23]; 分裂 的开始即注定要形成后侧中胚层(LPM[3], 然后发生系列特异性分化基因的表达 [24]。经过遗传形态学演变, LPM 形成一个纵向的造血区－中间细胞团 ICM 区，其不仅表达gata1, 且形成了具有红细胞循环的循环系统。 另一独立造血区位于胚胎囊胚泡背侧面，位于心脏起源细胞前面[25, 26]。它 们形成了LPM 的前部，伴随第一批原始髓系细胞的迁出，它们表达spil (pu.1) 而 不表达 gata1 [25, 27]。进入循环系统的活性吞噬细胞及胚胎巨噬细胞分布在卵黄 囊且贯穿于整个胚胎期, 推测具备特定表型的定居巨噬细胞[28], 在 48hpf 时可 能演变成为原始的中性粒细胞[29]。 决定性造血始于 48hpf 的胚胎, 这些细胞团位于背主动脉腹壁的 Notch-和 Hedgehog-信号区, 呈 runx-1 依赖性[30, 31]。此阶段的造血类似于哺乳动物背面 肠系膜(AGM)造血期。 在主动脉造血祖细胞的发育过程中 Runx1 的作用是必须 的[46-49][30, 32]。肾脏是幼虫发育至成鱼阶段最主要的造血器官[32]。 血细胞的形态学和生理学 斑马鱼体形较小，因此不像正常大型成年鱼类造血指标的简单直观。表 1 总 结了通过标志基因的检测, 细胞化学染色法, 免疫组化或者荧光转基因鱼的荧 光细胞法特异性识别血细胞类型。 特殊细胞通过流式细胞学对肾髓细胞悬液进 行物理特性的检测或者通过转基因鱼系的特殊系别荧光来进行鉴别, 细胞悬液须 取材于完整的胚胎[16, 33, 34]。 表 1 斑马鱼造血细胞的鉴定方法(来自 Duncan Carradice 的 zebrafish in hematology: sushi or science?) 5 万方数据 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 红细胞及红系造血 类似于鸟类和爬行