狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白高效表达体系的建立-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

鼻、 、 飞， ， ‘ ‘ Establishment Establishment of High Level Expression System for Glycoprotein and Nucleoprotein of Rabies Virus Cai Yueqin Supervisor：Professor Zhou Jiyong A Dissertation for Master’S Degree Submitted to the Faculty of Graduate School， Zhej iang University College of Animal Sciences Zhejiang University Hangzhou，Zhejiang Submitted in June，2006 月 、 、w ht d 论文创新点通过不同原核表达载体的比较和表达条件的优化，建立了狂犬病病 论文创新点 通过不同原核表达载体的比较和表达条件的优化，建立了狂犬病病 毒核蛋白基因和糖蛋白膜外区基因体外高效表达体系，并得到RV核蛋 白和糖蛋白的纯化产物，为下一步开发以重组蛋白作为检测抗原的 ELISA诊断方法奠定了基础。 10 t - 旷 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 目 录 蔡月琴2006 目录 摘 要 ．．- l ABSTRACT 。 ．3 第一部分文献综述 。5 1．狂犬病的流行情况 5 1．1 国外狂犬病流行情况 5 1．2中国狂犬病流行情况 ．7 2．狂犬病的临床特征 7 3．生态学 ．．． 8 4．狂犬病病毒分类地位 ．9 5．狂犬病病毒分子生物学特征 。lO 5．1病毒的组成及基因组结构 10 5．2 RV血清型 ll 5．3 RV基因型 ll 5．4病毒的复制 12 5．5病毒结构蛋白 12 5．5．1糖蛋白 12 5．5．2核蛋白 14 5．5．3磷酸蛋白 l 5 5．5．4基质蛋白 l 5 5．5．5 RNA聚合酶 l 5 6．致病机理 ．．1 5 6．1病毒侵入 ．16 6．2病毒在中枢神经系统中的传播 16 6．3 RV蛋白对神经细胞凋亡的作用 ．．17 6．4免疫反应 l 8 7．检测方法 ．1 9 7．1组织病理学 1 9 7．2 RV抗原检测 19 7．2．1荧光抗体试验 l 9 7．2．2免疫组织化学 20 7．2．3快速狂犬病酶免疫诊断法 20 7．2．4乳胶凝集试验 2 1 7．3生物学检测 2l 7．3．1 小鼠颅内接种分离狂犬病病毒法 2l 7．3．2狂犬病组织培养接种试验 21 7．4核酸检测 22 7．4．1 RT—-PCR 22 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 目 录 蔡月琴2006 7．4．2原位杂交 ．23 7．5血清学方法 ．23 7．5．1快速荧光灶抑制试验 。23 7．5．2酶联免疫试验 24 8．狂犬病疫苗 ．25 8．1狂犬病细胞疫苗 25 8．1．1 原代细胞疫苗 25 8．1．2人二倍体细胞疫苗(HDCV) 。25 8．1．3传代细胞疫苗 25 8．2我国的狂犬病疫苗 ．．25 8．2．1 纯化原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗 25 8．2．2传代Vero细胞狂犬病疫苗 26 8．3研究开发中的狂犬病疫苗 26 8．3．1 基因重组疫苗 ．26 8．3．2狂犬病DNA疫苗 ．27 8．3．3狂犬病基因突变减毒疫苗 。27 8．3．4新型佐剂疫苗 27 9．狂犬病防制措施 。27 第二部分研究内容 ．．29 第一章核蛋白基因在原核表达中的高效表达 29 1．材料 ．．． 。29 1．1病毒和细胞 29 1．2载体 。29 1．3 菌种 ．．29 1．4主要试剂 ．29 1．5抗生素 ．．． ．．． 29 1．6抗1本 。29 2．方法 ．．30 2．1病毒的增殖、纯化、浓缩及病毒RNA的提取 。30 2．1．1病毒增殖 30 2．1．2病毒基因组RNA抽提 30 2．1．3 RT-PCR引物设计与合成 ．．． ．．． 30 2．1．4 eDNA第一链合成 3 l 2．1．5 PCR ． ．． ．3l 2．2核蛋白基因的克隆 3 l 2．2．1 PCR产物割胶回收纯化 ．．． ．．3 I 2．2．2 j窑接 ．．32 2．2．3感受态细胞制备(CaCl2法) ．．．．．．．．． ．．． ．．． 32 2．2．4转化 ．32 2．2．5重组质粒筛选、鉴定 ．．． 。33 Ⅱ 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 目 录 蔡月琴2006 2．2．6 DNA琼脂糖电泳 。33 2．3核蛋白基因表达载体的构建 ．．． ．33 2．3．1 PCR纯化产物双酶切 33 2-3．2双酶切产物纯化 ： 30