利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统表达人生长激素的研究-生物工程专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 大连理工大学专业学位硕士学位论文摘 大连理工大学专业学位硕士学位论文 摘 要 柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)属昆虫杆状病毒，可专一性感染柞蚕。利用这一特 点研发的ApNPV表达载体系统己在柞蚕蛹中成功表达绿色荧光蛋白基因，但尚没有表 达具有生物学活性的蛋白的报道。本实验首次利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载 体系统分析人生长激素基因(k向)在柞蚕蛹体中的表达。构建了转移表达载体 pApM748BE／hgh，将转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-Aph／egfp+基因组DNA共 转染樗蚕(Philosamia cynthiam，Pc)培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒 ApNPV-Aph／Aegfp／hgh+。将该重组病毒感染柞蚕蛹，采用Western—blot和ELISA方法检 测分析人生长激素蛋I刍(hGH)在柞蚕蛹中的表达，结果显示：在柞蚕蛹感染重组病毒 ApNPV-Aph／Aegfp／hgh+后第7天，hGH就有明显的表达；感染后13～14天蛹体液中的 hGH含量保持较高水平，感染第15天至20天，仍可以检测到hGH的表达，但表达产 物出现降解现象；重组hGH最高表达量可达251．18pg／mL柞蚕蛹体液。用活化的人红 白血病细胞K562测定重组hGH的体外活性，检测结果显示柞蚕蛹表达重组hGH对人 红白血病细胞K562具有明显的促进增殖作用。对重组hGH进行了初步分离操作，确定 重组hGH的最佳硫酸铵盐析浓度为35％。验证了利用免疫亲和层析从感染了重组柞蚕 核型多角体病毒的柞蚕蛹体内分离纯化重组hGH的叮行性。本实验利用蚕蛹高效表达 有生物活性的hGH，为拓展柞蚕蛹的应用领域，开发基于hGH的药品和保健品打下了 良好的基础。 关键词：柞蚕蛹；核型多角体病毒表达载体系统：人生长激素； 万方数据 利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统表达人生长激素的研究Expression 利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统表达人生长激素的研究 Expression of Human Growth Hormone gene in Antheraea pernyi Pupa by Using Antheraea pernyi Nucleopolyhedrovirus Expression Vector System Abstract Antheraeapernyi nucleopolyhedrovirus(ApNPV)is a species ofthe insect baculovirus that carl infect the tussah pupa with high selectivity．The expression vector system has been developed based on this selective infecting characterist of ApNPV and successfully applied to express the green fluorescent protein gene in tussah pupa．While，there is no literature reported the application of recombinant ApNPV to express protein wim biologic activity． This study reported that human growth hormone(hgh)gene was expressed in Antheraea pernyi pupa by using ApNPV．The transfer vector，pApM748BE／hgh，was constructed and cotransfected into Pc一01 cell with the genomic DNA ofApNPV-Aph／egfp一．The recombinant virus，ApNPV-Aph／degfp／hgh+，was selected with the limited dilution method and identified by using PCR method．Pupae ofAntheraea pernyi were infected by ApNPV-Aph／Aegfp／hgh+and the expression of hgh was analyzed by using Western—blot and ELISA．The results showed that hgh was obviously expressed in pupae at 7