冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化及结构影响的研究-外科学专业毕业论文.docxVIP

学校代码： 学校代码： 10023 学 号：$2012020006 硕士学位论文 冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化 及结构影响的研究 所 院 国家卫生计生委科学技术研究所 姓 名 杨向棉 指导教师： 谷翊群 导师小组： 卢文红谷翊群 学科专业： 外科学 研究方向： 生殖医学 完成日期： 2015年4月30日 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部J硕士研究生学位论文目 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部J硕士研究生学位论文 目 录 摘i18兽． ．． ． ． 】【 Abstract ．3 1输言 。5 ：i】j：文． ． ． ． ． 9 第一部分：冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化影响的研究 ．9 1．实验材料 9 2．实验方法 ．11 3实验结果 。18 4实验讨论 一24 第二部分：冷冻技术对精子结构的影响 一28 1实验材料 ．．28 2实验方法 ．．29 3实验结果 一34 4实验讨论 34 第三部分：“雪域圣宝”对人类精子影响体外实验 38 1实验材料 ．．38 2实验方法 ～39 3实验结果 ．．43 4实验讨论 一45 文献综述 ．47 英文缩略词表(Abbreviation) ．55 致谢 57 个人简历 ．58 独创性声明 ．．59 学位论文版权使用授权书 ．59 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部j硕士研究生学位论文摘要 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部j硕士研究生学位论文 摘要 冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化及结构 影响的研究 目的：1．检测精子库常规精液冷冻技术中冷冻保护剂、冷冻过程及冷冻时间长短三 个因素对精子父源印记基因H19及母源印记基因MESTE[J记控制区域(imprinting control region，ICR)的DNA甲基化的影响程度，为冷冻精子在表观遗传方面的安全 性提供参考依据。2．检测精子库常规精液冷冻技术对精子DNA完整性、膜完整性 及顶体完整性的影响程度，为冷冻精子在结构方面的安全性提供参考依据。3．检测 样品“雪域圣宝”对人类精子影响体外实验的效果。 方法：1．以10例符合精子库捐精条件的正式志愿者为研究对象，将其每份精液样 品平均分为4组：A组为新鲜精液，作为对照；B组加入同体积冷冻保护剂，不冷 冻；C组加同体积冷冻保护剂，冷冻2d；D组加同等体积冷冻保护剂，冷冻两个月。 通过亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)分析父源印记基因H19及母源印记基因MEST ICR的DNA甲基化状态。2．以10例符合精子库捐精条件的初筛志愿者为研究对象， 对照组为新鲜精液，实验组加同体积的冷冻保护剂，冷冻7d。通过精子染色质扩散 实验(SCD)检测精子DNA完整性，通过改良6一羧基二乙酸荧光素／碘化丙啶 (6一CFDA／PI)双荧光标记方法检测精子质膜完整性，通过人精子豌豆凝集素(PSA) 荧光染色检测精子顶体完整性。3．以20例符合精子库捐精条件的初筛志愿者为研 究对象，对照组：0．5 ml精液与0．5 ml生理盐水混合；实验组：O．5 ml精液与0．5 ml 雪域圣宝混合，CASA计算加药前、0．5 h、3 h和24 h精子的活动率、平均路径速 率VAP、曲线速率VCL和直线速率VSL，0．5 h通过PSA荧光染色对精子顶体状态 进行评估，3 h时通过酶联免疫吸附实验(ELIsA)对精浆中DNA氧化损伤生物标 志物(8-OHdG)含量进行评估，24 h时通过伊红．苯胺黑法对质膜完整性进行评估。 结果：1．A、B、c、D组H19基因ICR区的DNA甲基化率以克隆数计算时分别为 58．70％、53．85％、49．46％和45．74％，以CpG岛数计算时分别为97．57％、97．33％、 97．13％和96．56％，两者都有降低趋势，但组间差异均无统计学意义(P0．05)； 四组MEST基因ICR区甲基化率以克隆数计算时分别为41．10％、45．33％、47．30％ 和50．68％，以CpG岛数计算甲基化率时分别为1．77％、1．74％、2．oo％t币I 2．26％， 有升高趋势，但差异亦无统计学意义(PO．05)。2．冷冻7 d的实验组DNA完整 率为(74 4-4．64)％，与未冷冻对照组(80 4-5．42)％相比，差异有统计学意义(P 0．05)；实验组膜完整率为(68 4-6．23)％，与对照组(75 4-5．82)％相比，差异有 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部J硕士研究生学位埝文统计学意义(P0．05)；实验组顶体完整率为(77-t-6．13)％，与对照组(82-4-5．71)％ 北京协和医学院中国医学科学院r清华大学医学部J硕士研究生学位埝文 统计学意义(P0．05)；实验组顶体完