利用定向蛋白组学液质串联技术对乳腺癌耐药相关膜蛋白的定量分析研究-药理学专业毕业论文.docxVIP

分类号：R96 分类号：R96 单位代码： 10312 密级： 学 号：南京医科犬掌 硕士学位论文 题 目： 歪l』周塞自蛋自组堂速厦皇送垫盔盟翌L照疸 煎荭塑差送蛋自数塞量金堑盈窒 学科专业： 完成时间： 三Q二亘生亘月 万方数据 南京医科大学学位论文原创性声明 南京医科大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 袖妨 日期：20IS年易月艿日 导师签名： 而L 日期：2D15年6月吕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“巾)： 1、保密口，在一年解密后适用本授权书。 √不保密口。 作者签名： 日期：如步年6月矿日／ 导师签名： 鹕肌LW兮谚w 日期：zD心年6月g日 万方数据 南京医科大学硕士学位论文目 南京医科大学硕士学位论文 目 录 中文摘要 ． ．1 ABSTRACT．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 前言．刖舌． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．5．．．．．．．．．．．．．．．．．．0 实验材料和方法 ．．8 1实验材料 8 1．1细胞株 8 1．2乳腺癌组织 ．．8 1．3主要试剂 ．8 1．4主要仪器 1 O 2实验方法 ．．1 1 2．1样品溶液配制 ．．1 1 2．1．1 P-gp贮备液、标准曲线和质控样品的配制 ．．1 1 2。1．2 TfR贮备液、标准曲线和质控样品的配制 1 1 2．2细胞培养和组织收集 ．．1 2 2．2．1细胞培养 ．1 2 2．2．2组织收集 ．． ．． 1 2 2．3膜蛋白提取 ．1 3 2．3．1细胞膜蛋白提取 ． ． ．．1 3 2．3．2组织膜蛋白提取 ．1 3 2．4基质溶液的制备 14 2．5溶液内胰蛋白酶水解反应及SPE富集纯化 ．．14 2．b SDS—PAGE和胶内胰蛋白酶水解反应及SPE富集纯化 ．．15 2．7质谱条件 15 2．7．1液相色谱一串联质谱(LC-MS／MS) 1 5 2．7．2飞行时间质谱(MALDI-TOF)．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．15 万方数据 南京医科大学硕士学位论文2．8稳定同位素标记的肽段内标物 南京医科大学硕士学位论文 2．8稳定同位素标记的肽段内标物 1 6 2．8．1稳定同位素标记的P-gp肽段内标物 ．．1 6 2．8．2稳定同位素标记的TfR肽段内标物 1 6 2．9方法学验证 ． 1 6 2．10常规的免疫学方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ．． ．．．1 6 2．10．1蛋白免疫印迹(western b l ott i ng) ．．17 2．10．2免疫组织化学(immunohi stochemi stry，川C) 18 2．10．3激光共聚焦(confoca I mi croscopy) ．21 2．1 0．4流式细胞术(f I cytometry) 21 3结果与讨论 22 3．1利用基于LC-MS／MS的定向蛋白质组学对P-gp的研究 ． 22 3．1．1细胞和组织的P—gp的提取 ． 22 3．1．2 P—gp胰蛋白酶水解特异性肽段在LC—MS／MS上的响应 23 3．1．3胰蛋白酶水解效率的考察 25 3．1．4 P—gp的LC-MS／MS方法的建立及验证． ． 26 3．1．5乳腺癌细胞中P-gp含量测定 ．．30 3．1．6乳腺癌组织中P—gp含量测定 ． ．33 3．2利用基于LC-MS／MS的定向蛋白质组学对TfR的研究 ．．37 3．2．1细胞和组织的TfR的提取 一 37 3．2．2 TfR胰蛋白酶水解特异性肽段在LC—MS／MS上的响应 ．38 3．2．3胰蛋白酶水解效率的考察 40 3．2．4 TfR的LC-MS／MS方法的建立及验证 41 3．2．5