利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因-果树学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否缥密 奄 如需保密，解密时间 年 月 日 i101 IIIIlll Iltlllllll IIIII tlH I IIf 独创性声明 Y3052602 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下迸彳亍的研究工作及取得的磅究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 袭或撰写过的研究成栗，也不包含为获得华中农业大学或其他教育视构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对她进行了审定。与我一溺工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生强私素 黼刎历年石其肌 学位论文使用授权书 揪搬挠笨青撇名：即 签名露期：加鸸年‘月，歹日 签名露期：山，占年 参月7字疆 注：请将本表直接装订在学位论文的痿页和嗣录之阚 万方数据 利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因目 利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因 目 录 摘要 ．i Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．．． ．．．．．．．． iii 缩略词表 一v l前言 l 1．1课题的提出 l 1．2前人研究进展 2 1．2．1植物类胡萝b素的生物活性及代谢途径 2 1．2．2植物类黄酮的合成与代谢 3 1．2．3植物挥发性物质的代谢 5 1．2．4植物相关转录因子的作用机理 6 1．2．5植物次生代谢相关转录因子 7 1．2．6调控番茄果实品质的相关转录因子 9 1．2．7病毒诱导的基因沉默及其应用进展 ～lO 1．3本课题内容、技术路线和科学意义 12 2材料和方法 ．13 2．1实验材料(试剂与仪器) 。13 2．2 TRV干涉载体构建 ．14 2．2．1转录因子筛选及引物设计 ．．14 2．2．2 PCR扩增目的基因 15 2．2．3 PCR产物回收并与pMDl8．T载连接： 16 2．2．4大肠杆菌热激转化及阳性质粒提取 。16 2．2．5双酶切与T4连接 17 2．3农杆菌侵染 ．17 2．4 RNA提取、反转录及qRT-PCR 18 2．4．1番茄叶片及果实RNA提取及反转录合成cDNA 18 2．4．2病毒检测及各侵染植株对应目的基因qRT-PCR 一18 2．5代谢组学分析 ．19 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．5．1类胡萝卜素提取及HPLC分析 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．5．1类胡萝卜素提取及HPLC分析 19 2．5．2类黄酮提取及LC．MS分析 ．20 2．5．3挥发性物质提取及GC—MS分析 20 2．6数据分析方法 一21 3结果与分析 22 3．1 TRV干涉载体构建 。22 3．1．1转录因子选择与扩增 22 3．1．2载体构建 23 3．2病毒侵染 ．26 3．2．1 TRV侵染番茄子叶和果实 26 3．2．2侵染后目的基因qRT-PCR及病毒检测 ．26 313代谢组学分析 ．29 3．3．1叶片和果实中类胡萝b素含量比较 29 3．3．2叶片和果实中类黄酮含量比较 33 3．3．3果实中挥发性物质含量比较 35 4讨{仑 一40 4．1萜类及类黄酮等代谢网络探讨 ．40 4．2与所研究转录因子互作的相关基因 ．43 4．3利用LC．MS检测果实类黄酮等物质变化中未知物探讨 43 4．4基于本研究的后续工作 ．44 参考文献 45 致谢 ．．54 万方数据 利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因摘要 利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因 摘要 番茄果皮和果肉中能够积累萜类和类黄酮物质，是初生和次生代谢相关基因功 能研究的良好模式材料。目前，人们对能同时调控番茄类胡萝卜素和类黄酮等代谢 途径的转录因子知之甚少。病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)不需要遗传转化操作， 可高效、快速地显著降低拟沉默基因的表达量，是研究转录因子功能的重要技术手 段。本研究以Micro．Tom番茄为材料，以TRV-PDS为阳性对照，利用VIGS、qRT．PCR 及HPLC、GC—MS、LC—MS等分析检测技术对7个柑橘同源基因进行筛选，结果表 明： 利用双酶切技术，己成功构建TRV-PDS阳性对照及7个柑橘同源基因的沉默 载体：通过叶片渗透、果柄注射两种方法侵染番茄植株，数天后，在新长出的叶片 及果实中通过PCR扩增均能检测到TRVl／TRV2病毒存在：