联合应用基因工程与组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究-骨外科学专业毕业论文.docx

联合应川基IN 联合应川基IN 1．程与组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究 联合应用基因工程与组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成 骨的实验研究 摘 要 目的：利用基因重组技术将人骨形态发生蛋白2(1lBMP2)基因转染 修饰人骨髓间充质干细胞(hMSCs)，测定hBMP2的表达情况，并将转 染有hBMP2的hMSCs与组织工程材料羟基磷灰石(HA)复合培养，植 入裸鼠体内以观察诱导异位成骨的能力，从基因工程与组织工程联合应用 角度作一些创新性的尝试，为临床骨修复及脊柱融合治疗提供新的思路和 方法。 方法：1．梯度离心法分离培养hMSCs，体外贴壁培养扩增，在倒置显 微镜下观察其形态、生长增殖情况以及诱导成骨能力等各种特性，并通过 流式细胞仪测定细胞表型。2．以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342bp 的成熟肽基因片段，将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序， 构建PBV220一hBMP2的原核基因表达系统，在DH5 a大肠杆菌下扩增并 42℃诱导表达hBMP2蛋白质，SDS．PAGE检测表达蛋白。3．设计内外两 对引物以巢式RT-PCR方法从成人肌肉组织内扩增出hBMP2全长1188bp 基因并且行T-A克隆装入pUCM．T质粒载体内，随后将质粒以HindIII和 Xba I双酶切后与pcDNA3载体相连接，构建pcDNA3．hBMP2的真核表 达载体系统，并利用脂质体介导转染hMSCs，通过对转染细胞的RT-PCR、 dot—ELISA、免疫组化以及ALP比活性的检测，了解干细胞hMSCs瞬时 及稳定表达hBMP2蛋白的情况。4．将转染后的hMSCs与生物组织工程材 料}认复合培养4d，光镜和扫描电镜下观察分析细胞在支架上的形态及 生长增殖，并将其复合培养植入到裸鼠的脊柱两侧的背脊肌内，4周后取 材，制作脱钙切片，观察其诱导新骨形成情况。 结果：1．梯度离心法能分离培养出较为纯化的hMSCs，细胞大都呈梭 联合虚用基H工程与组织工程技术诱导裸鼠脊撞异位成骨的实验研究 联合虚用基H工程与组织工程技术诱导裸鼠脊撞异位成骨的实验研究 中文摘要 形贴壁生长，体外培养具有快速增殖及诱导向成骨分化的能力，流式细胞 仪测定其细胞表型结果符合间充质干细胞的特性。2．经测序鉴定，克隆 扩增出342bp hBMP2的成熟肽基因片段与Genebank公布的序列完全一 致；且经双酶切后DNA电泳和蛋白电泳鉴定证实，成功构建了 PBV220一hBMP2的原核表达系统，并在DH5 a大肠杆菌42℃诱导下能表 达16KD的hBMP2蛋白质，诱导培养4小时后的蛋白表达量达到最高峰。 3．巢式RT-PCR方法能从成人肌肉组织内扩增出经测序完全相符的 1188bp的hBMP2全长cDNA基因，经酶切DNA电泳证实成功构建了 pcDNA3．hBMP2的真核表达载体，通过各种检测，从分子RNA转录水平 及蛋白水平上说明了，pcDNA3-hBMP2的真核表达系统能在hMSCs上表 达、分泌外源性的活性hBMP2蛋白，且蛋白的表达分泌具有稳定性。4． 经扫描电镜显示，转染后的hMSCs能在HA上贴附生长，增殖。经组织 切片显示转染细胞复合培养的HA植入裸鼠背脊肌内后，有新骨形成。 结论：1．梯度离心法能分离培养出具有快速增殖及诱导向成骨分化 潜能的hMSCs。2．由342bp的成熟肽hBMP2基因片段构建的 PBV220，hBMP2的原核表达系统，能在DH5 a大肠杆菌的温度诱导下表 达产生hBMP2蛋白质。3．巢式RT-PCR方法可扩增出1188 bp的hBMP2 全长cDNA基因，并且成功构建真核表达载体pcDNA3一hBMP2，可在 hMSCs上瞬时和稳定表达、分泌外源性的活性hBMP2蛋白。4．综合应 用基因工程和组织工程技术，将转染后的hMSCs与HA复合培养，具有 良好的生物相容性，植入裸鼠体内能诱导新骨形成。 关键词：基因疗法；组织工程；骨形态发生蛋白质类；间充质干细胞 异位成骨；裸鼠 作 者：俞莉敏 指导老师：郑祖根教授 II 联含斑用基因工程’l组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究Experiment 联含斑用基因工程’l组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究 Experiment Studies on Ectopic Osteogenesis of Athymic Mouse Spine Induced by the Use of Gene Engineering and Tissue Engineering Technology Abstract objfective：To explore some n