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中文摘要摘
中文摘要
摘 要
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在 昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,无环境污染, 但存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。对昆 虫病原真菌致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。海藻糖是 一种非还原性二糖,存在于所有已知种类的昆虫中,是昆虫血淋巴中主要的糖类 (大约占80—90%);海藻糖在昆虫血液生理中起着重要的作用,其耗竭可能对昆 虫起着致命性的作用。虫生真菌侵染进入昆虫血腔后,昆虫血淋巴中的海藻糖成 为真菌生长潜在和必需的营养物质。但海藻糖对许多真菌来说是非渗透性二糖, 必须在相应的二糖水解酶作用下分解为葡萄糖才能被真菌利用。金龟子绿僵菌侵 染进入昆虫血淋巴后,能分泌酸性海藻糖酶,有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖。 酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。
目前对真菌酸性海藻糖酶的研究较少,只有少数几个物种中酸性海藻糖酶基 因被克隆并测定序列。研究发现酸性海藻糖酶与中性海藻糖酶之间不具同源性, 并且不同酸性海藻糖酶基因之间序列同源性很差。这为酸性海藻糖酶的研究增加 了难度。在虫生真菌中,还未见酸性海藻糖酶基因克隆方面的报道。本研究以金 龟子绿僵菌(彪anisopliae)菌株CQMal02和东亚飞蝗为研究材料,对绿僵菌酸 性海藻糖酶培养条件和同工酶进行了系统的研究,并在此基础上采用离子交换、 分子筛层析等技术手段分离纯化出绿僵菌酸性海藻糖酶蛋白,对其分子量、等电 点以及其它酶学特性进行了详细的研究。在纯化的蛋白氨基酸测序的基础上,通 过设计寡核苷酸探针,对构建的绿僵菌基因组文库和随后的亚克隆进行了放射性 同位素筛选,结合RACE等技术手段,成功分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因并登 录NCBI的GenBank, 登录号为:DQ237957(基因组序列),DQ237958(eDNA序 列)。同时对绿僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染过程中的作用进行了较为详细的研究。 研究的结果为进一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了 基础。主要研究结果如下:
1.利用产物(葡萄糖)测定法,以酶活和同工酶为指标,筛选出适合CQMal02 酸性海藻糖酶产酶的培养基和产酶条件如下:
培养基:!.09/L K/-12P04,0.59/L MgS04,1.09/L KCI,log/L可溶性淀粉,59/L 蛋白胨,59;L酵母浸膏,pH值调至6.0。把1.0m11.O一3.0x10 7个/mlCQMal02孢子 悬液接种到100ml上述培养基中,在26℃、150rpm的条件下振荡培养3天,海藻
重庆大学博士学位论文糖水解酶总活性可达到14.125U/L,比活可达到0.4344U/mg。在该培养条件下,绿
重庆大学博士学位论文
糖水解酶总活性可达到14.125U/L,比活可达到0.4344U/mg。在该培养条件下,绿 僵菌产生两种海藻糖降解酶同工酶,其中一个等电点为8.4,而另一个为4.7。
2.经优化的纯化用产酶培养基为:1.0 g/L KH2P04,0.5 g/L MgS04,1.0 g/L KCI,2 g/L(NH4)2S04,10 g/L可溶性淀粉,10 g,L MES,初始pH 6.10。每100 ml 培养液接种3x10 7孢子。培养液在开放式摇床上150 rpm振荡培养72小时,培养 温度为26—27℃。
3.通过比较CQMal02菌丝提取液和滤液中海藻糖水解酶的活性,确定了海 藻糖水解酶在真菌细胞中的位置。结果表明:CQMal02海藻糖水解酶是分泌性蛋 白,主要分泌到培养基中,很少结合在细胞壁上。
4.经过两步阴离子交换层析,一步分子筛层析和一步窄范围等电聚焦分离, 得到了纯化的酸性海藻糖酶。该蛋白经SDS—PAGE和等电聚焦电泳(IEF)后,银 染,均显示为单一染色条带。该蛋白为糖蛋白,在SDS—PAGE上分子量为170kDa, 等电点为4.7。经去糖基化处理后,分子量降为130kDa左右。该酸性海藻糖酶最
适pH为5.5,最适反应温度为30C。其Ic50为1.3x10~M。纯化的绿僵菌酸性海 藻糖酶米氏常数(j%)为2.3 mM,最高酶促反应速度(%d为O.412 mmol min-1×mg protein4(以海藻糖为底物)。该纯化的酶在40℃孵育4小时,活性没有变化;在
50℃条件下,随孵育时间延长,酶活性线形降低;当孵育温度超过60℃,酶迅速
失去活性。该海藻糖酶具有很高的底物专一性,在测试的8种二糖中,只对海藻 糖有催化活性。Trehazolin,一种海藻糖酶特异性抑制剂,能有效地抑制该酶活性。 5.Edman降解法测定酸性海藻糖酶前15个氨基酸序列为:RD
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