里氏木霉信号传导途径对纤维素酶的合成调控-发酵工程专业论文.docxVIP

山东大学硕士论文第三章里氏木霉酪蛋白激酶II催化亚基0【l对纤维素酶的合成调控 山东大学硕士论文 第三章里氏木霉酪蛋白激酶II催化亚基0【l对纤维素酶的合成调控 ．37 3．1材料与方法 37 3．1．1实验菌株 37 3．1．2培养基 37 3．1．3常用试剂和设备 ．．38 3．1．4。[7低表达菌株nj．，“表达盒构建 ．．39 3。1．s o【，．f刃的真菌转化 47 3．1．6转化子验证 ．47 3．1．7酶活、蛋白和生物量的测定 ，．48 3．1．8荧光定量PCR实验 48 3．2结果与讨论 ．．49 3．2．1 a至低表达菌株鲥．把f的构建与验证 。．49 3．2．3 TU一6与dJ，．胞，菌株d，的表达差异 52 3．2．4 TU一6与a，．陀，菌株的不同碳源利用分析 ．s3 3．2．5 TU．6与倪J『．肥f菌株菌丝形态观察 ．54 3．2．6 TU一6与窿J．，鲥菌株生孢量的测定 s5 3．2．7 TU一6与87．fef菌株纤维素酶生产分析 ．．56 3．2．8 TU一6与6cj『．幻f菌株转录分析 ．．57 3．3本章小结 60 参考文献 ．．61 致谢 67 硕士期间取得成果 ．．69 万方数据 山东大学硕士学位论文摘要 山东大学硕士学位论文 摘要 里氏木霉是一种重要的纤维素酶产生菌，它可以分泌大量的纤维素酶和半纤 维素酶，但其产量远远达不到工业化要求。为了更好了解里氏木霉生产纤维素酶 和半纤维素酶的代谢网络，研究者已对其分子生理方面进行了大量研究，但是纤 维素酶调节的信号转导途径尚未清楚。 (1)在z，℃豁口冲存在3条不同的MAPKs途径Tmkl、Tmk2和Tmk3，分别与酵母 中的Fus3p、Slt2p和H091p相互对应。THll(2与孢子的形成和细胞壁的完整性维持 有关，但不参与纤维素酶的合成调控中的信号传递。Tmk3参与细胞壁完整性维 持、孢子形成、菌体生长、高渗透压抵抗等生理过程，并参与了纤维素酶的合成。 本文则以Tmkl为研究重点，探究其在里氏木霉中的生理功能及对纤维素酶的合 成调控。通过同源重组原理构建敲除株，分别为4，晰七Jr—l和4肋七Jf．2。由不同碳源 下的平板表型上敲除株的菌落直径均大于出发株，发现砌后J的敲除促进菌体生 长。比较出发菌株TU．6与4加臆』一l和d砌幻．2在对CR和CFW的敏感性，发现两者 对cR的承受力无明显差异，但随着CFw浓度的增加，敲除株较出发株的菌落直 径减小的快，表明，m露，的缺失使里氏术霉中的细胞壁完整性受到破坏。在微晶纤 维素双层平板上敲除菌较出发株具有更大的透明圈，通过3L的发酵罐实验看出敲 除株较出发株纤维素酶活力有不同程度的提高，说明tmkl的敲除有利于纤维素酶 形成。但是加2露-敲除并没有影响纤维素酶编码基因的转录。与Tlnk2和Tn_1l(3一起， 本文Trnkl的研究有助于说明MAPKs途径在里氏木霉纤维素酶合成中的作用。 (2)在里氏木霉的信号转导中，酪蛋白激酶II的作用尚不清楚。由于Ⅱ一基因不 能直接敲除，本文则通过使用Tet．on系统构建a，低表达菌栋c；c，．陀，，比较a，一f甜和 出发株的表型变化，从而研究酪蛋白激酶II催化亚基a1的生理功能。通过平板表 型分析发现n，．纪f较出发株生长=速度很大程度的减慢，在PDA平板上孢予生成的 数量大幅度减少。在以纤维二糖、微晶纤维素、等为单一碳源培养时，与出发株 相比，。【』，刎菌株的“』表达量降低，同时纤维素酶基因和c陀，基因的转录有不同程 度的上调。0cl的生理功能研究有助于揭示酪蛋白激酶II是如何调控纤维素酶的合 成。 关键词：里氏木霉；信号传导；纤维素酶；MAPKs；CKH 万方数据 山东大学硕士学位论文ABSTRACT 山东大学硕士学位论文 ABSTRACT 乃。比矗。如，铆口 理黜ef is t11e most important industrial cellulase巾roducillg filamentous 向ngus．Although it can secrete 1arge amounts of cellulase and hemicellulase，but its production is far less than industrial requirements．In ordef to better understand the metabolic network of Z陀酣Pf producting cellulase a11d hemicelluIase，now researchers have conducted extensive research on its molecular physiology；but the cellu