卵形鲳鲹病毒性神经坏死病及其LAMP快速检测方法研究-水产养殖学专业论文.docxVIP

答辩委员会成员名单● 答辩委员会成员名单 ● 姓名 工作单位 职称 备注 施志仪 上海海洋人学 教授 主席 中国水产科学研究院 李加儿 研究员 委员 南海水产研究所 中国水产科学研究院 邓国成 研究员 委员 珠江水产研究所 中国水产科学研究院 蔡文超 研究实习员 秘书 南海水产研究所 中国水产科学研究院 答辩地点 答辩日期 2010年6月14日 南海水产研究所 ● 11 卵形鲳鲣病毒性神经坏死病及其LAMP快速检测方法研究摘要 卵形鲳鲣病毒性神经坏死病及其LAMP快速检测方法研究 摘要 2008年春季，广东湛江一些网箱养殖的卵形鲳鳕Trachinotus ovatus幼鱼发生 ■ 大规模死亡，每个网箱每天死亡数十至上百尾鱼，累积死亡率超过90％。患病鱼 呈现出体色变黑、反应迟钝、身体失去平衡、呈螺旋状或旋转游动等典型的病毒 性神经坏死症症状。在鱼体没有发现寄生虫或细菌感染，PCR检测发现病鱼感染 了鱼类神经坏死病毒(NNV)。利用已经发表的NNV核酸序列设计引物，克隆该 神经坏死病毒(PNNV)外壳蛋白基因并测序，通过同源性比较和系统进化分析 发现该病毒与斜带石斑鱼神经坏死病毒(Ea心Ⅳ)碱基相似率达99．2％，属于赤 点石斑鱼神经坏死病毒基因型(RGMW)。 采用腹腔注射、肌肉注射、浸泡、投喂等4种方法进行人工感染试验。实验 鱼感染PNNV 4 d后，陆续出现食欲下降、体色较深或发黑、游动无力、行为反 应迟钝、身体失去平衡等病毒性神坏死症典型症状。死亡集中在攻毒后8～11 d， 攻毒后12 d各感染组累计死亡率均达100％，而对照组无死亡。提取人工感染实 验中具有典型症状鱼的脑组织总RNA，并进行RT．PCR检测，一扩阳性率达90％， PCR产物与PNNV的核酸序列完全相同。通过组织切片在光学显微镜下观察到病 鱼的脑部组织存在明显空泡，视网膜也有明显空泡性坏死病变，而脊髓、鳃、心 脏、肝脏、肾脏、脾和肌肉等器官没有发现明显的空泡。通过透射电镜可以在患 病鱼脑和视网膜结缔组织的细胞质内可以观察到直径20．30nm的病毒粒子。病毒 随机分布在细胞质中或者包在膜性结构内。偶尔可以观察到较大的致密体外膜已 经破裂．病毒样粒子释放到细胞质中。以上实验结果表明NNV是湛江市卵形鲳鳕 大规模死亡的致病原，也证明了卵形鲳鲣幼鱼是鱼类病毒性神经坏死症的易感种 群，患病死亡率高，可达100％。 本文根据RGNNV的RNA2的核苷酸序列，设计了一对特异性引物，采用荧 光定量PCR(qPCR)研究NNV在卵形鲳鳕体内各组织中分布及增殖规律。在感 染后4，8，12，24，36，48，72，96 h以及发病死亡的鱼中各采集6尾用于qPCR检测。 在感染后4 h，除肝和肠以外其他各组织均含有较高的病毒量。尤其是脑组织，达 到6．59-a：0．02 logl0 eopies／mg。各组织病毒增殖趋势均呈U字形(除肝和肠)，并 且病毒量分别在脑02 h p．i．)、心(12 h p．i．)、鳃(12 h p．i．)、脾(12 h p．i．)、肌肉(24 nI h h P．i．)和肾(36 h P．i．)时达到最低点。脑组织在感染后36 h，病毒含量达到平稳期， 为109 eopys／mg，此浓度与发病濒死或新鲜死亡个体组织中的浓度是一致的，其 他组织都在感染后96 h病毒含量达到最高浓度。证明此时，RGNNV已经扩散至 实验鱼体内各个组织。 本文还建立了一种以环介导等温扩增技术(LAMP)为基础的便捷、灵敏度 高、特异性好赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)快速检测方法。该方法以 ● RGNNV型基因组RNA序列为基础设计的4条特异性引物(2条外引物和2条内 引物)只能扩增该病毒的核酸序列，而不能扩增对虾白斑综合症病毒、锦鲤疱疹 病毒、传染性脾肾坏死病毒、锯缘青蟹呼肠孤病毒、草鱼出血病病毒，说明该方 法具有很高的特异性；本文还优化了该方法的反应条件，建立了最佳反应体系： 以10倍系列稀释的RGNNV eDNA为模板对LAMP和nested．PCR进行灵敏度检 测发现LAMP法的灵敏度比nested．PCR法高100倍。 关键词：神经坏死病毒，卵形鲳鲣，荧光定量PCR，环介导等温扩增 ● IV Study Study on Viral Nervous Necrosis Disease in Trachinotus ovatus And Development of the detection method based on LAMP ABSTRACT ● Investigation on mass mortality of Trachinotus ovatus juveniles cultured in sea cage in Zhanj