联合应用莱菔硫烷和利鲁唑对谷氨酸毒性造成的运动神经损伤的保护作用-神经病学专业论文.docxVIP

IIII IIII I I IF T TII II I I I I I IIl Y1 80 1 899 录 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 12 论文题目 联合应用莱菔硫烷和利鲁唑对谷氨酸毒性造成的运动神经元 损伤的保护作用 引言 14 第一部分谷氨酸兴奋性毒性模型的研究 前言刖舌 1l 66 材料与方法 l 7 结果 23 附图 24 附表 28 讨论 29 小结 30 参考文献 30 第二部分探讨联合应用莱菔硫烷和利鲁唑是否有协同保护作用 前言刖舌 3333 材料与方法 j ．．34 结果 41 附图 45 附表 50 讨{仑 53 小结 54 参考文献 54 第三部分联合应用莱菔硫烷和利鲁唑对运动神经元损伤的保护机制的 探讨 前言刖舌 ．．56．．56 材料与方法 56 结果 62 ～ ～～64 ～～65 ～～67 69 附附讨小参 图表论结考 ～文～献，^L 69 ～ ～ ～～! 72 ～～84 综致个 述谢人 ～简 ～历 ～～85 造经元的一种慢 造 经元的一种慢 性进行性的神经系统变性疾病。临床表现为缓慢进展的四肢肌肉无力，常 累及咽喉肌和呼吸肌等。患者多于发病3．5年内死亡。该病目前病因不清， 尚无有效治疗。近年来FDA批准的新药利鲁唑临床开始应用，但仅能延 长生存期，且价格昂贵、副作用大，一些患者不能耐受，临床并未广泛应 用。所以，迫切地需要进一步了解该病的发病机制，寻求新的治疗药物。 ALS的发病机制主要集中在以下几个方面：1)Cu／Zn SOD基因突变； 2)谷氨酸的兴奋毒作用；3)线粒体功能异常；4)氧化应激；5)小胶质细 胞增生等。多数学者认为多种因素相互作用导致了ALS的发病，其中谷 氨酸的兴奋性毒作用和氧化应激是ALS的发病过程中最重要的两个致病 因素。谷氨酸作为神经系统的一种重要的神经递质，对维持神经细胞的正 常生理功能至关重要，但高浓度的谷氨酸则具有神经毒性作用。中枢神经 系统维持谷氨酸生理浓度主要依赖于运动神经元和星型胶质细胞的谷氨 酸转运体。当谷氨酸转运体功能或结构异常时就会直接造成细胞外谷氨酸 浓度的异常增高，激活谷氨酸AMPA受体，引起细胞内钙超载，钙离子大 量积聚直接引起线粒体去极化、能量代谢损伤、使产生ATP的电子传递 链解耦联，随之大量自由基从线粒体电子传递链中释放，造成严重的氧化 应激损伤；同时在运动神经元或反应性增生的胶质细胞又内产生的大量 ROS，又会导致星形胶质细胞上谷氨酸转运功能的破坏。 多种发病机制在运动神经元损伤的过程中起作用，同时临床试验也证 明了，采用单一的治疗策略效果都不理想。因此，联合应用不同机制的药 物治疗运动神经元病是未来研究的重点。我们在研究中联合应用力鲁唑和 莱菔硫烷治疗运动神经元病，以期取得良好的疗效。 利鲁唑是一种经典的抗谷氨酸药物，也是目前公认的可延缓ALS病 程的药物。近年来，很多体内和体外的研究证实，利鲁唑不仅能降低细胞 外的谷氨酸浓度，而且能有效保护谷氨酸转运体，加强谷氨酸转运体对谷 中文摘要 中文摘要 氨酸的摄取。 莱菔硫烷(sulforaphane，SF)广泛存在于十字花科中，可以激活 Nrf2／ARE信号通路。而Nrf2／ARE信号通路的激活，可诱导一系列内源 性抗氧化酶和抗氧化蛋白上调，协同加强细胞清除ROS／RNS的防御系统， 维持细胞内的还原电位。因此，有学者推断此通路有望成为神经变性疾病 治疗的新靶点。Nrf2是位于胞浆中一个转录因子，而ARE是存在于多种 抗氧化酶和抗氧化蛋白基因的5’侧翼的顺式DNA调节元件，称为抗氧化 反应元件。正常情况下，Nrf2被Keapl锚定在胞浆内，Keapl是与actin 结合一个的富含半胱氨酸残基的调节蛋白，扮演着分子开关的角色。当 Keapl感受到ROS或诱导剂的信号后发生构象改变与Nrf2解离，Nrf2向 核内移位与ARE结合后诱导下游靶基因的表达。 我们应用谷氨酸转运体抑制剂苏．羟天冬氨酸(THA)诱导的脊髓体 外器官型培养谷氨酸兴奋性毒性模型，探讨联合应用莱菔硫烷和利鲁唑对 谷氨酸毒性造成的运动神经元损伤的协同保护作用，并研究联合用药的保 护机制。研究表明联合应用莱菔硫烷和利鲁唑对谷氨酸毒性造成的运动神 经元损伤的有协同保护作用，比单一用药有优势。这对于研究肌萎缩侧索 硬化的发病机制提供了坚实的理论依据，并提出了新的联合用药模式。 第一部分谷氨酸兴奋性毒性模型的研究 目的：探讨建立THA诱导的脊髓器官型培养模型。 方法：应用脊髓体外器官型培养模型，随机分成2组：对照组、THA 组。用免疫组化法检测运动神经元数目，用多功能酶标仪检测