类溶菌酶2等五个新基因的克隆和功能研究-遗传学专业论文.docxVIP

类溶菌酶2等五个新基因的克隆和功能研究中文摘要 类溶菌酶2等五个新基因的克隆和功能研究 中文摘要 ／ (由于生物基因组进化中的保守性，具有某一功能的基因在不同物种之间常具 有一定的同源性，种问差异越小，同源度越高；另外，来自同一物种的基因家族 成员之间由于功能或结构上的相似，也具有一定的同源性。因此利用这种基因间 的同源性，有目的的克隆基因家族新成员，是一种适合于在经费较少的实验室进 行新基因克隆的有效策略，它对后续的基因功能研究具有承先启后的提示式指导 作用：本研究以若干已知具有重要功能的基因的cDNA为信息探针，采用“同源 筛选”的策略进行基因克隆，分离和鉴定了5个分别与代谢、免疫、转录调控、 蛋白修饰及细胞生长等功能相关的新基因。它们分别是小鼠硅酸甘油酸变位酶城 。型Pgaml)、些型(Pgam2)、拳姿菌酶圣LYZ2)、垂鱼劈酸鳗酶调节亚l基(JDPP3月2) 和肝癌衍生生长因子2(HDGF2)。 瞵酸甘油酸变位酶(EC5．4．2．1)(phosphaglycerate mutase，PGAM)是一种糖 分解酶。本研究利用同源筛选策略克隆了小鼠磷酸甘油酸交位酶的脑型(Pgaml) 和肌型(Pgam2)cDNA(：i册号分别为AF283667，AF029843)。Pgaml eDNA开 放阅读框为765bp，编码254个氨基酸，Pgam2 cDNA开放阅读框为762bp，编 码253个氨基酸．基因组序列分析Pgam2中含有三个外显子和两个内含子．同 时还发现了Pgaml的假基因Pgaml-psl，在GenBank注册号为AF276657。 Northern杂交显示Pgaml基因在脑和’肾组织中高表达，在肝、胸腺、胃和心脏 组织呈中等表达，均有一个2．1kb的转录本。Pgam2基因在肌肉和睾丸组织中有 高表达，而在心脏和肺组织中度表达，转录本为1．Okb，在所检测的其它六种组织 中没有表达。用RH基因定位方法将Pgaml和Pgam2分别定位于距D19Mit52 和Dl IMitl29位标116．16 cR及29．57 cR．将分别载有这两种cDNA开放阅读 框的重组质粒瞬时转染至COS7细胞中进行酶活力检测，确定了Pgaml和Pgam2 的磷酸甘油酸变位酶活性． 溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一种特异作用于微生物细胞壁的水解酶，广泛存 在于动植物和微生物中。80年代以来溶菌酶已被广泛用于食品和医药工业。在 医学中有抗茵消炎，抗病毒和抑制肿瘤生长等功能。我们克隆了一个新的溶菌酶 同源基因LYZ2(GenBank注册号为AFl39543)，其eDNA长758bp．包含一长 450．bp的ORF，编码148个氨基酸残基．Pc—GENE分析LYZ2 1-19位氨基酸可 能为信号肽。Northern杂交结果显示LYZ2仅在胎盘和脑组织中有可检测的转录 本，大小约0．9Kb。通过和基因纽序列比较将LYZ2基因定位在10号染色体。 将LYZ2和￡yZ稳定转染至CHO细胞，以细胞表达上清作用金黄葡萄球菌， 溶壁微球菌，铜绿假单孢菌，白色念珠球菌和枯草杆菌悬液，结果显示在所检测 的5种菌株中，LYZ对溶壁微球菌的溶菌活性最高，LYZ2对白色念珠球菌的溶 菌活性最高。分别用含有抗生素并口不合抗生素的LYZ2与LYZ作用细菌悬液， —— —— 一 鲞查堕竺!!墨尘堑墨苎竺圭竺皇兰堂竺至 结果表明，抗生素对LYZ和LYZ2的溶菌活性影响有所不同。 钙调磷酸酯酶3(PPP3，protein phosphatase 3)是参与多种细胞功能调节的 多功能信号酶。我们在人EST库中拼接了与小鼠Ppp3r2基因高度同源序列 PPP3月2，并用引物延伸方法确定了其转录起始点，在GenBank登录号为 AFl45026。PPP3R2 cDNA长1058bp，编码170个氨基酸残基。引物延伸结果显 示尸P丹R2基因有4个转录起始点。该基因与大鼠及小鼠Ppp3rl的氨基酸水平 的一致性分别高达82．9％和80．5％。表达谱分析显示PP．P3R2仅在睾丸组织中 存在一条高表达的1．0Kb和一条低表达的4．0kb的转录本，在成熟精子中也检 测到PPP3R2基因的表达。对基因组结构分析结果显示，尸PP3尺2基因没有内 含子．其基因上游没有TATA框存在，而是富含GC，可能是其存在散在转录 起始点的原因。Southem结果显示PPP3R2在基因组中仅存在一个拷贝，睾丸 组织基因组DNA中PPP3尺2上游所检测的GC位点存在部分去甲基化，而脑， 肌肉和脾脏基因组DNA中此GC位点甲基化。PPP3R2基因上游GC位点部 分去甲基化可能是组织特异表达的原因之一。RH定位系统将该基因精确定位 于9q22的D9S176和D9S271问。。 肝癌衍生生长因子(hepat