狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选-内科学专业论文.docxVIP

目 目 录 一、 摘要 1、中文论著摘要 ．．1 2、英文论著摘要 ．．5 二、 英文缩略语 ．11 三、 论文 论文一新西兰黑鼠狼疮肾炎易感基因的染色体定位研究 l、前言 ．12 2、材料与方法 ．13 3、结果 ．16 4、讨论 ．20 5、结论 ．．23 论文二新西兰鼠SLE候选基因结构区突变位点的筛选 1、前言 ．24 2、材料与方法 ．25 3、结果 ．33 4、讨论 ．．36 5、结论 ．39 论文三新西兰黑鼠突变基因与狼疮性肾炎的相关关系研究 l、前言 ．．40 2、材料与方法 ．4l 3、结果 ．43 4、讨论 ．45 5、结论 ．49 四、 本研究创新性的自我评价 5l 五、 参考文献 52 六、 附录 1、综述 ．59 2 2 成 绩 7 76 4 科致个 研谢人 ～简 ～历 77 ·中文论著摘要·狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选 ·中文论著摘要· 狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选 目 的 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多基因相关的自 身免疫性疾病，其肾脏损害一狼疮性肾炎(Lupus Nephritis，LN)为经典的免疫 复合物性肾病，发病机制复杂，是多个基因与各种环境因素相互作用的累加结果。 就个体而言，任何单个基因均不具有决定性意义，不同的遗传背景及环境暴露因 素决定了个体的不同临床表型。同时就群体而言，单个易感位点的外显率很低或 呈现不完全外显，不同的家系因具有不同的基因组合，而表现出不同的SLE发病 过程，即有或没有LN。 从遗传学角度来看，长期的进化和社会文明的发展使人类成为一种高度杂和 性物种，具有很高的遗传变异性。同时由于缺乏对易感基因的自然选择过程，使 各种易感基因遍布于普通人群中。而且因为伦理的原因人类环境暴露因素、遗传 差异无法控制，如果直接进行易感基因定位，要达到理想的灵敏度及特异性，往 往需要采集大量家系或几百对同胞对DNA标本。在实际研究中要获得如此庞大 的均质病例十分困难。鼠与人类基因具有高度同源性和同线性，小鼠模型中的研 究结果可直接用于人类相同或相关基因的研究。 本研究通过建立(NZB×NZW)F1×NZW小鼠模型，以尿蛋白为狼疮性肾 炎表现进行全基因组扫描。首先确定NZB(New Zealand Black，NZB)鼠的狼疮 肾炎易感基因在染色体上的位置。然后利用基因组计划已取得的成果，绕过繁琐 的叠连群．cDNA杂交过程，直接对易感区域内已克隆的基因测序，鉴定出NZB 与NZW(New Zealand White，NZW)之间存在差异的基因。最后利用单链构象 多态性(Single-Strand Comformation Polymorphism，SSCP)电泳技术分析这些突 变基因与狼疮小鼠蛋白尿的相关关系，以探讨LN易感基因在小鼠模型中的意义。 材料与方法第一部分：选择(NZBXNZW)F1 材料与方法 第一部分：选择(NZBXNZW)F1 XNZW雌性回交鼠220只，从4月龄开 始每2周测定1次尿蛋白，以监测肾脏损伤情况，尿蛋白大于11lmg／dl为阳性标 准。为便于数量性状位点(QTL)分析，肾脏受累程度依尿蛋白浓度分6级：0 级37mg／dl，1级≥37mg／dl，2级；一74mg／dl，3级≥11lmg／dl，4级7333mg／dl, 5级／1000mg／dl，6级73000mg／dl。以酚．氯仿法提取鼠尾基因组DNA标本，选 定合适的可覆盖小鼠全部19条染色体的微卫星遗传标记进行DNA样本的PCR 扩增，根据微卫星DNA片段的长度多态性确定回交鼠的基因型。将全部小鼠的 狼疮性肾炎表现型数据和基因型数据录入MAPMAKEP．／QTL及 MAPMANAGER／QTL分析软件包，进行基因组扫描以确定NZB来源的狼疮肾易 感基因染色体定位。以LOD值13．3为表型与遗传标记间具有显著连锁关系。根 据上述连锁分析的结果，将小鼠按不同基因型分组，观察各组间蛋白尿的时间累 积发生率，确定不同易感位点的相互关系。组间比较采用x 2检验，P0．05认为 有统计学意义。 第二部分：利用ISOGEN试剂盒分别提取NZB、NZW小鼠的脾、肝、肾总 RNA，RT-PCR合成鼠eDNA。查询Mouse Genome Informatics(MGI)数据库的表 达基因图谱，在易感遗传标记附近确定与免疫功能及调控有关的候选基因41个， 针对基因CDS区设计引物69对。热启动PCR分别扩增上述引物的NZB、NZW 鼠cDNA，选取合适PCR产物及相应引物进行测序，考虑测序精度，大于600bp 的片断全部采用双向测序。结果利用Chromas软件判读，对存在碱基变异处进一 步确定有无氨基酸序列变化。 第三部分：