磷细菌溶磷动力学的研究及酶解植酸基因工程菌的构建-微生物学专业论文.docx

南升大孥博士毕业论文摘要 南升大孥博士毕业论文 摘要 本文采用有效磷和全磷测定的方法，对液体法培养的用于制备微生物肥料的磷细 菌的溶磷作用进行了研究。研究结果表明，磷细菌9320一SD24菌株可使含磷矿粉的液 体培养基中的有效磷量增加了1985．45 u mol／L；使含磷矿粉的液体培养基中的全磷转 化率达31．12％。 以磷矿粉为底物研究了磷细菌9320一SD24溶磷的动力学。采用消煮法测定全磷含 量、钼锑抗比色法测定速效磷含量、以平板菌落活菌计数法计数磷细菌生长量。结果 表明。当底物浓度一定时，产物形成速率与磷细菌生长速率及菌体浓度成正比，产物形 』D 成比速率仅与生长速率成正比。并得到磷细菌溶磷动力学方程：；=a u x，无效磷转 口r 化动力学方程为：Y=4．5419x+l 1．23。 设计筛选培养基，从203株细菌菌株中筛选到1株具有较高植酸酶活力的菌株 SD01N。设计植酸酶基因特异引物P。、P。，以SDOIN菌株的基因组DNA为模板，以PCR 的方法进行基因扩增，并经电泳检测，得到一条明显的扩增条带，大小约1．2Kb。对 PCR产物进行序列分析表明，该片段含有一个编码383个氨基酸的开放阅读框架。将 该片段与载体pQE一30连接后转化大肠杆菌￡coil M15，得到重组菌株LTP01，对该 菌株进行培养，经IPTG诱导基因表达，与携带空载体菌株相比较，在菌株LTP01中 可检测到植酸酶产物。对重组菌株LTP01的植酸酶活力考察表明，该植酸酶在25。C 95。C温度范围均具有酶活性，酶促反应的最适温度为65 4C，属于耐热性植酸酶。在各 pH缓冲系统中反应结果，酶活力出现二个较高值，分别为pH4．6和pH7．5。 由菌株LTP01提取重组质粒，经相同的双酶切处理，将植酸酶基因重新组合在载 体pHT315上，得到重组DNA pHT315P。以pHT315P电转化生产微生物肥料的磷细菌 9320-SD24，得到植酸酶工程菌株SDLTP02。SDLTP02菌株可以使植酸释放出供给植物 生长所需要的可吸收磷素，促进植物的生长。SDLTPD2所释放的磷营养可以使玉米苗 比对照组的平均株高增加20．Omm；玉米苗鲜重增加69．5mg／株；玉米苗干重增加 13．5mg／株；玉米苗平均根长增加5．Omm。SDLTP02植酸酶工程菌既保持了溶磷矿粉 的溶磷特性，又能酶解植酸，适宜作为磷细菌肥料进行商业开发。 龠开大掌博士毕|潍文关键词：耐热植酸酶 龠开大掌博士毕|潍文 关键词：耐热植酸酶 克隆 大肠杆菌 Bacillus sp． 磷细菌 溶磷动力学 磷矿粉 肃开大学博士毕业论文Abstract 肃开大学博士毕业论文 Abstract The phosphorus dissolving action of phosphobacteria 9320一SD2a cultured in 1 iquid medium was studied by the instant phosphorus assay，the whole phosphorus assay．The instant phosphorus was increased a range of 1985．45 u mot／L in liquid medium containing powdered rock phosphate．The transformation rate Of the instant phosphorus from whole phosphorus was 31．12％． In this study the kinetics properties of phosphorus dissolving by the phosphorus bacteria 9320一SD24 is reported using the powdered rock phosphate as reactive material．The samples were treated with№S04～H202 for the whole phosphorus assay．The active phosphorus(di ssolving phosphorus)in the samples were determined by calorimetry．The amount of living cells was numbered in colony—forming units by cultivating on solid medium．The results indicated that the rate of product forming had a dire