酪氨酸酶基因表达的磁共振成像（MRI）研究-放射医学专业论文.docxVIP

酪氨酸酶基因表达的磁共振成像(MRJ)研究 酪氨酸酶基因表达的磁共振成像(MRJ)研究 中文摘要 中 文摘要 目的：(1)研究pcDNA3．0一tyr在正常人成纤维母细胞株(GM0639细胞)中的表达： (2)探讨tyr基因表达MR成像的相关因素：(3)评价1．5 T MR机观察研究 pcDNA3．0．tyr在SHG44荷瘤裸鼠体内表达。 方法：(1)采用氯化钙法pcDNA3．0一tyr真核表达载体导入大肠杆菌DH5 n菌珠，氨苄 青霉素筛选，挑取阳性克隆接种培养，按质粒抽提试剂盒提取、纯化质粒，经测序、 酶切后琼脂凝胶电泳鉴定；选择真核细胞电击模式，pcDNA3．0-tyr转染GM细胞， 提取总RNA，RT-PCR检测，取PCR产物进行琼脂凝胶电泳，利用DNA Marker鉴 定扩增片段大小的正确性；测定490 nnl吸光度值，细胞爬片Fontana染色，证实酪 氨酸酶基因表达及其表达水平；(2)细胞种类及量均相同，转染量分别为599、10l-tg、 1599、2099 pcDNA3．0一tyr载体及pcDNA3．0空载体101．tg，比较各自MRI信号强度 的变化；(3)不同细胞含量，依次为1×106、5X 105、2．5×105、1．25×105、6．25 ×104，各加入1099 pcDNA3．0-tyr质粒，比较各自信号强度的差异：(4)细胞量、 转染质粒量相同，转染后继续培养用的完全培养基中的硫酸铁含量不同，终浓度分 别为O．599 Fe／ml、2．5／．tg Fe／ml、599 Fe／ml，比较3组MR信号强度的差异：(5)其 它实验条件相同，一组转染后先培养24h，再用含有硫酸铁的完全培养基换液继续培 养48h，另一组转染后先培养60h，再用含有硫酸铁的完全培养基换液继续培养12h， 比较两组问MR信号强度的差异，评价铁加入时间对其影响：(6)细胞量(含106个 细胞)、转染质粒量(10Ftg pcDNA3．0-tyr)等实验条件完全相同，比较GM细胞、SHG44 细胞和T98细胞间酪氨酸酶活性及MR信号强度的差异；(7)裸鼠10只，分两组。 实验组(6只)先pcDNA3．0．tyr电穿孔法转染SHG44胶质瘤细胞，经G418筛选后， 接种至裸小鼠右腿上部皮下(50ul，约含2×106个细胞)，对照组(4只)转染pcDNA3．0 空载体。接种后第4W行1．5 T MR检查。采用小孔径线圈及自行设计的增加信噪比 装置，各组实验动物均作轴位、冠状面T1wI和T2WI。MR检查后处死，取肿瘤组 织进行HE染色、电镜及免疫组化检查。 酪氨酸酶基因表达的磁共振成像(MR／)研究 酪氨酸酶基因表达的磁共振成像(MR／)研究 中文摘要 结果：(1)测序结果提示pcDNA3．0-tyr真核表达载体中含有酪氨酸酶全长eDNA片 段，与Genebank数据库中比对，序列正确：提取、纯化后的pcDNA3．0一tyr质粒，酶 切后经凝胶电泳分离，获得两个清晰条带，一条大小约1．8kb，与酪氨酸酶基因的 eDNA大小相符；另外一条大小约5．4kb，为空pcDNA3．0载体条带。PCR产物琼脂 凝胶电泳结果表明：转染pcDNA3．0一tyr的GM细胞相当于DNA Marker 600bp处存 在一条带，与事先设计的扩增片段大小完全相符，而转染pcDNA3．0空载体的GM 细胞PCR产物无此条带。说明pcDNA3．0。tyr转染GM细胞获得成功；转染 pcDNA3．0．tyr的GM细胞的A490显著高于转染空载体的细胞及未转染的GM细胞 (PO．001)，而转染空载体的GM细胞乜90与未转染组相比差异无显著性(P0．05)， 提示GM细胞在转染peDNA3．0一tyr后有较强的酪氨酸酶活性；细胞爬片Fontana染 色表明，转染pcDNA3．0一tyr的GM细胞胞浆内见棕褐色银沉着颗粒，而转染 pcDNA3．0空载体以及未转染的细胞内缺乏此棕褐色颗粒；(2)随着转染量的增大， 酪氨酸酶活性亦相应增强，MRTlwI信号强度随之升高，5 ug组与10 ug组之间MR 信号变化最为突出，大于10 ug的转染量时，MR信号上升趋势平缓，20 ug组甚至 呈轻度下降趋势；酪氨酸酶活性与MR T1WI平均信号强度之间存在极显著的相关关 系，相关系数r=0．904，p0．001：(3)在同一细胞株(GM细胞)相同质粒量，不同 细胞量的情况下，各组MR信号强度均较高，组间无显著性差异(pO．05)。但细胞 量直接与高信号的面积相关，以全量(106细胞)组的高信号面积最大，其次为含1／2 细胞团的组别，含1／4、1／8、1／16细胞团的组别MR高信号的范围渐次缩小，有显 著统计学差异(pO．001)：(4)在同一细胞株